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【摘要】 目的：观察幼年及成年小鼠海马齿状回中Neurogenin2（Ngn2）的表达，通过比较新生及成年小鼠神经元生成水平与Ngn2的表达，初步分析其对成年神经元生成的影响。方法：将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（7 d）和成年组（4月），每组6只。两组小鼠均接受腹腔注射Bromodeoxyuridine（Brdu） 3 d，2次/d，于最后一次注射后2 h进行灌注、取脑、包埋标本。采用免疫荧光技术对Ngn2、Brdu、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并进行细胞计数，初步分析Brdu、Ngn2双阳性细胞的细胞类型及表达水平。结果：（1）Ngn2阳性细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层；并且大部分Ngn2阳性细胞同时表达Brdu；（2）幼年组Ngn2+/Brdu+细胞数量明显多于成年组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：Ngn2主要表达于分裂状态下的神经前体细胞，其表达与神经再生水平呈正相关。由此可以认为，在神经元生成过程中，Ngn2亦对神经前体细胞向神经元分化起着重要作用。
【关键词】 Neurogenin2； 齿状回； 神经元生成
海马齿状回的颗粒细胞下层（SGZ）与侧脑室室管膜下区（SVZ）是神经元生成的主要部位，在哺乳动物的整个生命周期中，始终有新的神经元生成，只是在成年时保持相当低的水平，并且随着年龄的增长，新生神经元的数量亦逐渐减少。神经元生成的过程包括多能干细胞的增殖、分化、迁移和成熟，并受多种内源性和外源性因素的调节，包括遗传因素、神经营养因子、神经递质、激素、蛋白激酶和应激等[1]。近年的研究表明，在发育过程中，碱性螺旋-环-螺旋基因（basic Helix-Loop-Helix genes，bHLH genes）表达于海马齿状回中的神经前体细胞中，同时在成年神经元生成过程中起着至关重要的作用[2-3]，Neurogenin2（Ngn2）作为原神经bHLH基因，其对海马齿状回中神经元生成的作用还不清楚，目前国内尚无相关研究。本文为了研究Ngn2在成年神经元生成过程中的作用，以神经元生成非常活跃的新生小鼠（10 d）为对照，检测成年小鼠中Ngn2的表达，以期初步阐述Ngn2的表达与成年神经元生成的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（7 d）和成年组（4个月），每组6只，成年小鼠于动物室饲养一周以适应环境。
1.2 Brdu给药方法与脑片标本制备 全部小鼠接受腹腔注射Brdu 3 d，2次/d，于最后一次注射后2 h予水合氯醛麻醉，常规灌注、断头取脑，入4%多聚甲醛固定过夜，然后于20%蔗糖脱水至标本沉底。选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚度为35 μm，每隔140 μm取一张脑片。将脑片放入防冻液中保存以备用。
1.3 免疫荧光染色 通过免疫荧光技术对Ngn2、Brdu、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并进行细胞计数。具体步骤如下：将脑片于PBS中洗3次（5 min/次），后转入1 mol/L
的HCL，在45 ℃下进行DNA变性半小时（只有含Brdu的染色才进行此步骤），恢复到室温后，再次用PBS洗3次（5 min/次），后转入柠檬酸钠中，80 ℃下抗原修复半小时，待其恢复到室温，继续PBS洗3次（5 min/次），然后在适量封闭液中室温下摇床1 h。吸去原有封闭液，再次加入封闭液，依次按比例加入一抗，完毕后放入4 ℃冰箱24～48 h。取出脑片，恢复到室温后继续PBS洗3次（5 min/次），转入0.3%Triton中，避光条件下，分别按比例加入二抗，37 ℃摇床1 h，PBS洗3次（5 min/次），避光铺片、甘油封片。最后在荧光显微镜下观察脑片。
1.4 结果分析与统计学处理 400倍光镜下观察小鼠齿状回颗粒细胞下层Brdu与Ngn2双阳性细胞数，以及Ngn2与其他细胞标记蛋白的表达。每只小鼠随机选取6个非连续的脑片进行Ngn2/Brdu双阳性细胞计数。实验结果以（x±s）表示，使用SPSS 10.0软件包行统计学分析。
2 结果
2.1 Ngn2的表达部位 新生小鼠海马齿状回尚处于生长发育阶段，与成年小鼠相比，有更多的神经元生成。Brdu可经细胞分裂而整合入新生的细胞DNA中，故Brdu阳性细胞数量就大致代表了新生神经元的数量，从结果中可以看到新生小鼠的神经元生成水平明显高于成年小鼠，见图1 A和E（封三）；同时，通过对Ngn2进行免疫荧光染色，其表达水平与Brdu相一致，且只局限于SGZ，分别以单个、成对、成簇的方式存在，见图1 B和F（封三）。为了进一步对Ngn2阳性细胞定性，笔者还进行了未成熟神经元标记物DCX与成熟神经元标记物Neun的染色，但是，Ngn2既不与DCX合并表达，见图2（封三），亦不表达于成熟神经元（NeuN阳性细胞）。
2.2 Ngn2+/Brdu+细胞数的比较 Ngn2与Brdu的合并染色表明，只有部分Brdu阳性细胞与Ngn2阳性细胞重合，但是几乎所有Ngn2阳性细胞共同表达Brdu，见图1 C和H（封三）。通过对各层面脑片的细胞计数，新生小鼠中双阳性细胞数明显高于成年组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1与图3（封三）。
3 讨论
上世纪60年代，成年哺乳动物中神经元的生成已经是一个不争的事实。Ngn2作为一种bHLH的原神经转录因子，受Hes1的双重调节：当Hes1处于波动表达状态，那么Ngn2亦呈低水平的波动表达，此时，Hes1与Ngn2共同维持着神经干/祖细胞增殖状态；而当Hes1表达被抑制，则Ngn2表达增加，介导神经前体细胞的增殖及向神经元方向分化[4]。所以，在胚胎发育过程中，其对脑与脊髓的发育有至关重要的作用[5]，甚至可作为海马神经前体细胞的分子标记物[6]。有研究表明，随着年龄的增加，神经元生成水平逐渐下降[7]，C57/BL6小鼠在出生后的前7天，DG增长相对缓慢，7～14 d为快速增长期，而后增长速度再次减缓，到3个月趋于稳定[8]，所以，幼年小鼠齿状回颗粒细胞下层的神经元生成亦处于活跃期。本实验中，笔者证实了幼年小鼠齿状回Brdu阳性细胞明显多于成年小鼠，说明幼年小鼠神经元生成的数量显著多于成年小鼠。体外实验表明，Ngn2单一的过表达即可引起神经干细胞向谷氨酸能神经元方向分化、成熟[9]，而在齿状回的发育过程中它的缺失则引起齿状回神经前体细胞向神经元方向分化障碍及齿状回结构与功能的异常[10]。因此，笔者推测Ngn2在幼年与成年小鼠中的表达差异，导致了神经元生成水平的不同。实验结果表明，幼年小鼠Ngn2的表达明显高于成年小鼠，并且幼年小鼠中Brdu与Ngn2双阳性细胞数显著高于成年小鼠（P<0.01）。同时，笔者还进行了Ngn2与DCX、Neun的双染色，发现Ngn2并不表达于未成熟神经元（DCX+，图2）及成熟神经元（NeuN+，结果未显示），且Ngn2的表达只局限于齿状回的颗粒细胞下层，说明Ngn2可能只表达于增殖状态下的神经前体细胞，而不表达于神经干细胞（GFAP+细胞）[11]及已定型的神经前体细胞（DCX+细胞）。在胚胎发育过程中，正是其短暂的表达才介导了神经前体细胞退出细胞有丝分裂周期而向神经元方向分化[10]。由此笔者可初步认为，Ngn2在成年个体中的低表达直接或间接引起了新生神经元数量明显减少，但是其在成年神经再生中的作用机制尚需进一步的研究，比如在某些损伤因素下（脑缺血、脑外伤等），Ngn2的表达是否发生变化及影响神经元的生成；通过上调或抑制Ngn2的表达研究其对神经元生成的作用，对于神经系统损伤后的修复具有重要意义。 参考文献
[1] Balu D T，Lucki I.Adult hippocampal neurogenesis：regulation，functional implications，and contribution to disease pathology[J].Neurosci Biobehav Rev，2009，33（5）：232-252.
[2] Pleasure S J，Collins A E，Lowenstein D H.Unique expression patterns of cell fate molecules delineate sequential stages of dentate gyrus development[J].J Neurosci，2000，20（4）：6095-6105.
[3] 郇林春，杨新宇，赵旺淼，等.Hes1在成年小鼠脑中表达的免疫组织化学分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（4）：5.
[4] Shimojo H，Ohtsuka T，Kageyama R.Dynamic expression of notch signaling genes in neural stem/progenitor cells[J].Front Neurosci，2011，5（12）：78.
[5] Nieto M，Schuurmans C，Britz O，et al.Neural bHLH genes control the neuronal versus glial fate decision in cortical progenitors[J].Neuron，2001，29（15）：401-413.
[6] Raineteau O，Rietschin L，Gradwohl G，et al.Neurogenesis in hippocampal slice cultures[J].Mol Cell Neurosci，2004，26（34）：241-250.
[7] Kuhn H G，Dickinson-Anson H，Gage F H.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat： age-related decrease of neuronal progenitor proliferation[J].J Neurosci，1996，16（8）：2027-2033.
[8] 郭敏，张张.C57/BL6小鼠海马结构发生、发育和衰老过程中的细胞增殖[J].解剖学杂志，2012，35（15）：4.
[9] Thoma E C，W E，Offen N，et al.Ectopic expression of neurogenin 2 alone is sufficient to induce differentiation of embryonic stem cells into mature neurons[J].PLoS One，2012，7（6）：13.
[10] Galichet C，Guillemot F，Parras C M.Neurogenin 2 has an essential role in development of the dentate gyrus[J].Development，2008，135（58）：2031-2041.
[11] Steiner B，Kronenberg G，Jessberger S，et al.Differential regulation of gliogenesis in the context of adult hippocampal neurogenesis in mice[J].Glia，2004，46（15）：41-52.
（收稿日期：2013-01-25） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 Neurogenin2； 齿状回； 神经元生成
海马齿状回的颗粒细胞下层（SGZ）与侧脑室室管膜下区（SVZ）是神经元生成的主要部位，在哺乳动物的整个生命周期中，始终有新的神经元生成，只是在成年时保持相当低的水平，并且随着年龄的增长，新生神经元的数量亦逐渐减少。神经元生成的过程包括多能干细胞的增殖、分化、迁移和成熟，并受多种内源性和外源性因素的调节，包括遗传因素、神经营养因子、神经递质、激素、蛋白激酶和应激等[1]。近年的研究表明，在发育过程中，碱性螺旋-环-螺旋基因（basic Helix-Loop-Helix genes，bHLH genes）表达于海马齿状回中的神经前体细胞中，同时在成年神经元生成过程中起着至关重要的作用[2-3]，Neurogenin2（Ngn2）作为原神经bHLH基因，其对海马齿状回中神经元生成的作用还不清楚，目前国内尚无相关研究。本文为了研究Ngn2在成年神经元生成过程中的作用，以神经元生成非常活跃的新生小鼠（10 d）为对照，检测成年小鼠中Ngn2的表达，以期初步阐述Ngn2的表达与成年神经元生成的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（7 d）和成年组（4个月），每组6只，成年小鼠于动物室饲养一周以适应环境。
1.2 Brdu给药方法与脑片标本制备 全部小鼠接受腹腔注射Brdu 3 d，2次/d，于最后一次注射后2 h予水合氯醛麻醉，常规灌注、断头取脑，入4%多聚甲醛固定过夜，然后于20%蔗糖脱水至标本沉底。选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚度为35 μm，每隔140 μm取一张脑片。将脑片放入防冻液中保存以备用。
1.3 免疫荧光染色 通过免疫荧光技术对Ngn2、Brdu、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并进行细胞计数。具体步骤如下：将脑片于PBS中洗3次（5 min/次），后转入1 mol/L
的HCL，在45 ℃下进行DNA变性半小时（只有含Brdu的染色才进行此步骤），恢复到室温后，再次用PBS洗3次（5 min/次），后转入柠檬酸钠中，80 ℃下抗原修复半小时，待其恢复到室温，继续PBS洗3次（5 min/次），然后在适量封闭液中室温下摇床1 h。吸去原有封闭液，再次加入封闭液，依次按比例加入一抗，完毕后放入4 ℃冰箱24～48 h。取出脑片，恢复到室温后继续PBS洗3次（5 min/次），转入0.3%Triton中，避光条件下，分别按比例加入二抗，37 ℃摇床1 h，PBS洗3次（5 min/次），避光铺片、甘油封片。最后在荧光显微镜下观察脑片。
1.4 结果分析与统计学处理 400倍光镜下观察小鼠齿状回颗粒细胞下层Brdu与Ngn2双阳性细胞数，以及Ngn2与其他细胞标记蛋白的表达。每只小鼠随机选取6个非连续的脑片进行Ngn2/Brdu双阳性细胞计数。实验结果以（x±s）表示，使用SPSS 10.0软件包行统计学分析。
2 结果
2.1 Ngn2的表达部位 新生小鼠海马齿状回尚处于生长发育阶段，与成年小鼠相比，有更多的神经元生成。Brdu可经细胞分裂而整合入新生的细胞DNA中，故Brdu阳性细胞数量就大致代表了新生神经元的数量，从结果中可以看到新生小鼠的神经元生成水平明显高于成年小鼠，见图1 A和E（封三）；同时，通过对Ngn2进行免疫荧光染色，其表达水平与Brdu相一致，且只局限于SGZ，分别以单个、成对、成簇的方式存在，见图1 B和F（封三）。为了进一步对Ngn2阳性细胞定性，笔者还进行了未成熟神经元标记物DCX与成熟神经元标记物Neun的染色，但是，Ngn2既不与DCX合并表达，见图2（封三），亦不表达于成熟神经元（NeuN阳性细胞）。
2.2 Ngn2+/Brdu+细胞数的比较 Ngn2与Brdu的合并染色表明，只有部分Brdu阳性细胞与Ngn2阳性细胞重合，但是几乎所有Ngn2阳性细胞共同表达Brdu，见图1 C和H（封三）。通过对各层面脑片的细胞计数，新生小鼠中双阳性细胞数明显高于成年组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1与图3（封三）。
3 讨论
上世纪60年代，成年哺乳动物中神经元的生成已经是一个不争的事实。Ngn2作为一种bHLH的原神经转录因子，受Hes1的双重调节：当Hes1处于波动表达状态，那么Ngn2亦呈低水平的波动表达，此时，Hes1与Ngn2共同维持着神经干/祖细胞增殖状态；而当Hes1表达被抑制，则Ngn2表达增加，介导神经前体细胞的增殖及向神经元方向分化[4]。所以，在胚胎发育过程中，其对脑与脊髓的发育有至关重要的作用[5]，甚至可作为海马神经前体细胞的分子标记物[6]。有研究表明，随着年龄的增加，神经元生成水平逐渐下降[7]，C57/BL6小鼠在出生后的前7天，DG增长相对缓慢，7～14 d为快速增长期，而后增长速度再次减缓，到3个月趋于稳定[8]，所以，幼年小鼠齿状回颗粒细胞下层的神经元生成亦处于活跃期。本实验中，笔者证实了幼年小鼠齿状回Brdu阳性细胞明显多于成年小鼠，说明幼年小鼠神经元生成的数量显著多于成年小鼠。体外实验表明，Ngn2单一的过表达即可引起神经干细胞向谷氨酸能神经元方向分化、成熟[9]，而在齿状回的发育过程中它的缺失则引起齿状回神经前体细胞向神经元方向分化障碍及齿状回结构与功能的异常[10]。因此，笔者推测Ngn2在幼年与成年小鼠中的表达差异，导致了神经元生成水平的不同。实验结果表明，幼年小鼠Ngn2的表达明显高于成年小鼠，并且幼年小鼠中Brdu与Ngn2双阳性细胞数显著高于成年小鼠（P<0.01）。同时，笔者还进行了Ngn2与DCX、Neun的双染色，发现Ngn2并不表达于未成熟神经元（DCX+，图2）及成熟神经元（NeuN+，结果未显示），且Ngn2的表达只局限于齿状回的颗粒细胞下层，说明Ngn2可能只表达于增殖状态下的神经前体细胞，而不表达于神经干细胞（GFAP+细胞）[11]及已定型的神经前体细胞（DCX+细胞）。在胚胎发育过程中，正是其短暂的表达才介导了神经前体细胞退出细胞有丝分裂周期而向神经元方向分化[10]。由此笔者可初步认为，Ngn2在成年个体中的低表达直接或间接引起了新生神经元数量明显减少，但是其在成年神经再生中的作用机制尚需进一步的研究，比如在某些损伤因素下（脑缺血、脑外伤等），Ngn2的表达是否发生变化及影响神经元的生成；通过上调或抑制Ngn2的表达研究其对神经元生成的作用，对于神经系统损伤后的修复具有重要意义。 参考文献
[1] Balu D T，Lucki I.Adult hippocampal neurogenesis：regulation，functional implications，and contribution to disease pathology[J].Neurosci Biobehav Rev，2009，33（5）：232-252.
[2] Pleasure S J，Collins A E，Lowenstein D H.Unique expression patterns of cell fate molecules delineate sequential stages of dentate gyrus development[J].J Neurosci，2000，20（4）：6095-6105.
[3] 郇林春，杨新宇，赵旺淼，等.Hes1在成年小鼠脑中表达的免疫组织化学分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（4）：5.
[4] Shimojo H，Ohtsuka T，Kageyama R.Dynamic expression of notch signaling genes in neural stem/progenitor cells[J].Front Neurosci，2011，5（12）：78.
[5] Nieto M，Schuurmans C，Britz O，et al.Neural bHLH genes control the neuronal versus glial fate decision in cortical progenitors[J].Neuron，2001，29（15）：401-413.
[6] Raineteau O，Rietschin L，Gradwohl G，et al.Neurogenesis in hippocampal slice cultures[J].Mol Cell Neurosci，2004，26（34）：241-250.
[7] Kuhn H G，Dickinson-Anson H，Gage F H.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat： age-related decrease of neuronal progenitor proliferation[J].J Neurosci，1996，16（8）：2027-2033.
[8] 郭敏，张张.C57/BL6小鼠海马结构发生、发育和衰老过程中的细胞增殖[J].解剖学杂志，2012，35（15）：4.
[9] Thoma E C，W E，Offen N，et al.Ectopic expression of neurogenin 2 alone is sufficient to induce differentiation of embryonic stem cells into mature neurons[J].PLoS One，2012，7（6）：13.
[10] Galichet C，Guillemot F，Parras C M.Neurogenin 2 has an essential role in development of the dentate gyrus[J].Development，2008，135（58）：2031-2041.
[11] Steiner B，Kronenberg G，Jessberger S，et al.Differential regulation of gliogenesis in the context of adult hippocampal neurogenesis in mice[J].Glia，2004，46（15）：41-52.
（收稿日期：2013-01-25） （本文编辑：陈丹云）