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【目的】研究牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒，通过Western blotting进行验证，并通过Reed-Muench法测定病毒滴度，通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】成功扩增到E0、E2基因目的片段，大小分别为681和1 122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×1010 PFU/mL;Western blotting检测结果显示，Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达，得到了与预期相符的目的条带（65 ku）;ELISA检测结果表明，通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平；流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4+、CD4+/CD8+比值均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。【结论】本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性，能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。