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摘要[目的]检测丝瓜络反硝化滤池内主要微生物菌群，优化滤池运行参数。[方法]综合使用PCR-DGGE、高通量测序等微生物分析手段，研究了该滤池内生物群落结构。[结果]填料表面微生物多样性丰富，优势菌属为红假单胞菌属、绿棒菌属、红芽生菌属、芽生绿菌属、气单胞菌属。[结论]该研究结果对于提高反硝化滤池处理污染物的效率具有指导意义。
关键词丝瓜络填料；微生物分析；反硝化生物滤池
中图分类号X52文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）20-0060-05
Abstract[Objective] To test the main microbial flora in the loofah denitrification biofilter and optimize the operation parameters.[Method] The community structure of the filter was studied by means of PCRDGGE，high throughput sequencing and other microbiological analysis methods.[Result] The microbial diversity on the surface of the stuffing is abundant.The dominant species were Rhodopseudomonas，Chlorobaculum，Rhodoblastus，Blastochloris，Eromonas. [Conclusion]The research results have guiding significance for improving the efficiency of denitrifying filter treatment pollutants.
Key wordsLoofah filler；Microbiological analysis；Denitrification filter
目前，我國污水處理厂普遍采用的污水处理工艺有A/O、氧化沟和SBR 等，由于受原污水 COD/N 较低的限制，加之长期以来我国污水处理厂污染物排放标准中仅规定了氨氮（NH4+-N）和总氮（TN）的最高允许排放浓度，且 TN 最高允许排放浓度比NH4+-N至少高 10 mg/L，这些因素导致污水处理厂出水中 TN 至少有 60%为硝酸盐氮，部分污水处理厂出水硝酸盐最高可达20 mg/L[1]，并已造成地表及地下水体不同程度的硝酸盐污染[2-3]。水体中过高的硝酸盐浓度直接影响供水水质安全，对婴幼儿具有毒害作用，在人体内可转化为致癌物质[4]；另一方面，可导致温室性气体N2O的产生[5-6]。因此，降低硝酸盐浓度已经成为水处理研究中的重要课题[7-13]。
常规去除硝酸盐的办法有离子交换、反渗透和生物法[14]，但离子交换和反渗透由于价格昂贵，处理费用较高，去除效果有限，而难以达到推广应用[15-19]。而生物法中反硝化生物滤池是解决该类问题经济有效的方法之一。其中反硝化是将硝酸盐或者亚硝酸盐氮转变为气态氮的生物过程[20-21]，而反硝化生物滤池中起关键作用的就是生长在载体填料上的微生物。笔者研究了以丝瓜络为填料的生物滤池，分析其微生物特征，以期找到更优异的填料，旨在为以丝瓜络为填料的生物滤池处理生活污水提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验装置
试验采用的反应器由有机玻璃圆柱制成，高420 cm，内径12 cm，有效体积47 L（图1）。球形丝瓜络填料直径为8 cm，每个球形填料中丝瓜络重量为5 g左右。采用间歇运行的方式，进水时间为6 min，流量为0.47 m3/h。
1.2试验材料
试验采用运行稳定、且控制在最优脱氮条件下的丝瓜络填料为研究对象，对其进行微生物分析。
1.3分析方法
1.3.1Miseq高通量测序生物信息学分析。
首先提取样品基因组DNA，设计并合成引物接头，再进行PCR扩增及产物纯化，待纯化完成后，进行PCR产物定量和均一化，最后进行高通量测序。测序完成后对序列进行数据统计分析及生物信息学分析。
1.3.2PCR-DGGE技术原理及环境微生物群落多样性分析。
DGGE是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段检测。该试验流程如图2所示。
2结果与分析
2.1PCR-DGGE测序结果
2.1.1DGGE凝胶电泳图。试验共取3个样品进行测定，每个样品取2组平行（样品1平行样记为1-1和1-2，样品2平行样记为2-1和2-2，样品3平行样记为3-1和3-2）。采用Biolinker DNA Red染液对DGGE胶图进行泡染，染色完成后的胶图在Bio-Rad凝胶成像仪上进行拍照，结果见图3。
通过Quantity-One软件分析原DGGE胶图，将胶图转换成直观的条带分布图（图4），位于同一水平线的为相同物种，该图左右两侧的数字为经分析后该板胶共有的条带数（也可认为是该板胶上所有样本包含的物种数）。最下面一行表示以第1个样本为基准的前提下，其余样本与第1个样本的相似性。
图4下方的百分数中1对应的100%表示以样品1-1为基准，在该条件下，其余样本与该样本的相似性。可以看出，1-1与1-2、2-1与1-2、3-1与3-2非常相似，说明取样情况较好，能够反映各样品的真实情况。同时可知，样品1与样品2的相似性在85%左右，与样品3的相似性仅在70%，说明样品1和样品2群落结构更相似。 2.1.2生物群落多样性指数。
由表1可知，样品1的群落多样性最高，样品2最小。
2.1.3非加权组平均法（UPGMA）进行样品间的聚类分析。UPGMA
是一种较常用的聚类分析方法。通过Quantity One软件的UPGMA法所产生的系统发生树可以直观地看到各样品之间的相似性。由图5可知，对于3个样品所取的平行组，相似系数均在95%以上，说明这3个样品取样均一，能够代表样品的真实情况，并且从图5中也可以看出样品1和样品2的相似性更高。
2.1.4克隆测序汇总。PCR-DGGE的胶条切下共16条（编号1～6）进行回收，扩增区域：16S，克隆测序结果见表2。由表2可知，菌种Chlorobium limicola strain DSM 245，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677，Magnetospirillum bellicus strain VDY，Rhodoblastus acidophilus strain DSM 137，Clostridium saccharobutylicum strain NCP 262的相似性均為100%，说明这些菌种是3个样品共有的菌种，而其中Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677菌属相似度为100%，条带占比100%，说明该菌种是3个样品的优势菌种。Chondromyces Robustus strain Cm a13，Chloroba culum parvum NCIB 8327，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Thiomonas perometabolis strain ATCC 23370、Dyella thiooxydans strain ATSB10菌种的数目也较多，且在3个样品中也基本都有。
2.2高通量测序结果
通过PCR-DGGE分析结果可知，6个样品均具有较好的代表性。同时也为了节约测序成本，采用编号1-1样品代表样品1，编号2-1代表样品2，3-1代表样品3来开展高通量测序工作。
2.2.1指数分析结果统计。由在指定的相似水平为97%（0.03）的条件下，样品的各多样性指数见表3。由表3可知，样品2-1的OTU序列数最高，1-3最低，而3个样品中1-1的优化序列划分得到的OTU数目最多，为1 566。由此可知，1-1和3-1样品的物种总数较多，样品3-1的香农指数最高，为3.48。各样品文库的覆盖率均在98%以上，样本中序列没有被测出的概率较低，覆盖较深，可见该次测序结果能够充分代表样本的真实情况。
2.2.2稀释性曲线。图6是在97%相似水平下划分OUT并绘制出的各样品稀释曲线。知以看出，3个样品的曲线趋向平坦，说明这3个样品的取样数量合理，取样深度足够，能够代表样品的真实情况。
2.2.3各样本间在门分类水平的比较。
在门分类水平上，根据各样品中微生物组成绘制柱状图，比较各样本在门分类水平上群落结构组成的差异，结果见图7。由图7可知，1-1、1-2样品在门水平上群落结构比较相似，与1-3样品中群落结构略有差距，这与DGGE测序得出的结果一致。主要体现在1-1、1-2样品群落结构中，绿菌门（Chlorobi）数目占的比例最大，变形菌门（Proteobacteria）次之，而1-3样品中变形菌门最多，其次是绿菌门。在拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）等菌门上，差距不明显。
2.2.4热图（Heatmap）。
Heatmap 可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行聚类，将聚类后的数据表示在heatmap图上，通过颜色的梯度及相似程度来反映数据的相似性和差异性。
图8是根据属水平上OTU中所含序列的数量位于前50的信息进行绘制，分别按照样品和分类进行聚类后做出Heatmap图，能够反映出样品在属水平上表现的相似性或者差异性。
由图8可知，3个样品的菌落结构在菌属水平上非常相似，红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、绿棒菌属（Chlorobaculum）、红芽生菌属（Rhodoblastus）、芽生绿菌属（Blastochloris）、气单胞菌属（Aeromonas）是这3个样品共同的优势菌属，其中绿棒菌属在所有的菌属中丰度最大，而此菌属一般为光能无机自养型，专性厌氧，在无氧、有光照的水体中生长。说明试验装置中溶解氧浓度非常低，厌氧环境好。同时反应装置由有机玻璃制成，透明，光照条件好，有利于这些菌属的生长。
3结论
（1）该研究结果表明，DGGE测序与高通量测序结论基本一致。而DGGE测序只能检测到主要的微生物，如果总量占1%以下，便不能被检测到，高通量测序样品检测到26门35纲55目85科153属，说明DGGE显著低估了微生物的群落组成。通过对比这两种测序方法可知，高通量测序的检测灵敏度是DGGE的4～39倍，若进一步分析样品主要微生物类群的相对丰度，发现分类水平越低，高通量测序与DGGE的结果差异越大，尤其在科和属的水平上差异最大[22]。并且高通量测序能够较为全面和准确的反映微生物群落结构，而DGGE仅能够反映有限的优势微生物类群，在很大程度上极可能低估微生物的物种组成并高估其丰度。
（2）以丝瓜络作为反硝化滤池的填料，通过高通量测序以及基于PCR-DGGE技术的环境微生物群落多样性分析，初步得出：优势菌属为红假单胞菌属、绿棒菌属、红芽生菌属、芽生绿菌属、气单胞菌属。
丝瓜络作为反硝化滤池填料时，微生物生长状况良好，表面微生物比较丰富，初步认为丝瓜络可以作为反硝化生物滤池的填料。
参考文献
[1]
李魁晓，白雪，李鑫玮，等.城市污水厂二级处理出水深度处理组合工艺研究[J].环境工程学报，2012，6（1）：63-67.
[2] 刘相超，周政辉，宋献方，等.梁滩河地表水与地下水水化学及硝酸盐污染[J].重庆交通大学学报（自然科学版），2009，28（5）： 942-947.
[3] KIM R H，LEE J，CHANG H W.Characteristics of organic matter as indicators of pollution from smallscale livestock and nitrate contamination of shallow groundwater in an agricultural area[J].Hydrological processes，2003，17（12）：2485-2496.
关键词丝瓜络填料；微生物分析；反硝化生物滤池
中图分类号X52文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）20-0060-05
Abstract[Objective] To test the main microbial flora in the loofah denitrification biofilter and optimize the operation parameters.[Method] The community structure of the filter was studied by means of PCRDGGE，high throughput sequencing and other microbiological analysis methods.[Result] The microbial diversity on the surface of the stuffing is abundant.The dominant species were Rhodopseudomonas，Chlorobaculum，Rhodoblastus，Blastochloris，Eromonas. [Conclusion]The research results have guiding significance for improving the efficiency of denitrifying filter treatment pollutants.
Key wordsLoofah filler；Microbiological analysis；Denitrification filter
目前，我國污水處理厂普遍采用的污水处理工艺有A/O、氧化沟和SBR 等，由于受原污水 COD/N 较低的限制，加之长期以来我国污水处理厂污染物排放标准中仅规定了氨氮（NH4+-N）和总氮（TN）的最高允许排放浓度，且 TN 最高允许排放浓度比NH4+-N至少高 10 mg/L，这些因素导致污水处理厂出水中 TN 至少有 60%为硝酸盐氮，部分污水处理厂出水硝酸盐最高可达20 mg/L[1]，并已造成地表及地下水体不同程度的硝酸盐污染[2-3]。水体中过高的硝酸盐浓度直接影响供水水质安全，对婴幼儿具有毒害作用，在人体内可转化为致癌物质[4]；另一方面，可导致温室性气体N2O的产生[5-6]。因此，降低硝酸盐浓度已经成为水处理研究中的重要课题[7-13]。
常规去除硝酸盐的办法有离子交换、反渗透和生物法[14]，但离子交换和反渗透由于价格昂贵，处理费用较高，去除效果有限，而难以达到推广应用[15-19]。而生物法中反硝化生物滤池是解决该类问题经济有效的方法之一。其中反硝化是将硝酸盐或者亚硝酸盐氮转变为气态氮的生物过程[20-21]，而反硝化生物滤池中起关键作用的就是生长在载体填料上的微生物。笔者研究了以丝瓜络为填料的生物滤池，分析其微生物特征，以期找到更优异的填料，旨在为以丝瓜络为填料的生物滤池处理生活污水提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验装置
试验采用的反应器由有机玻璃圆柱制成，高420 cm，内径12 cm，有效体积47 L（图1）。球形丝瓜络填料直径为8 cm，每个球形填料中丝瓜络重量为5 g左右。采用间歇运行的方式，进水时间为6 min，流量为0.47 m3/h。
1.2试验材料
试验采用运行稳定、且控制在最优脱氮条件下的丝瓜络填料为研究对象，对其进行微生物分析。
1.3分析方法
1.3.1Miseq高通量测序生物信息学分析。
首先提取样品基因组DNA，设计并合成引物接头，再进行PCR扩增及产物纯化，待纯化完成后，进行PCR产物定量和均一化，最后进行高通量测序。测序完成后对序列进行数据统计分析及生物信息学分析。
1.3.2PCR-DGGE技术原理及环境微生物群落多样性分析。
DGGE是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段检测。该试验流程如图2所示。
2结果与分析
2.1PCR-DGGE测序结果
2.1.1DGGE凝胶电泳图。试验共取3个样品进行测定，每个样品取2组平行（样品1平行样记为1-1和1-2，样品2平行样记为2-1和2-2，样品3平行样记为3-1和3-2）。采用Biolinker DNA Red染液对DGGE胶图进行泡染，染色完成后的胶图在Bio-Rad凝胶成像仪上进行拍照，结果见图3。
通过Quantity-One软件分析原DGGE胶图，将胶图转换成直观的条带分布图（图4），位于同一水平线的为相同物种，该图左右两侧的数字为经分析后该板胶共有的条带数（也可认为是该板胶上所有样本包含的物种数）。最下面一行表示以第1个样本为基准的前提下，其余样本与第1个样本的相似性。
图4下方的百分数中1对应的100%表示以样品1-1为基准，在该条件下，其余样本与该样本的相似性。可以看出，1-1与1-2、2-1与1-2、3-1与3-2非常相似，说明取样情况较好，能够反映各样品的真实情况。同时可知，样品1与样品2的相似性在85%左右，与样品3的相似性仅在70%，说明样品1和样品2群落结构更相似。 2.1.2生物群落多样性指数。
由表1可知，样品1的群落多样性最高，样品2最小。
2.1.3非加权组平均法（UPGMA）进行样品间的聚类分析。UPGMA
是一种较常用的聚类分析方法。通过Quantity One软件的UPGMA法所产生的系统发生树可以直观地看到各样品之间的相似性。由图5可知，对于3个样品所取的平行组，相似系数均在95%以上，说明这3个样品取样均一，能够代表样品的真实情况，并且从图5中也可以看出样品1和样品2的相似性更高。
2.1.4克隆测序汇总。PCR-DGGE的胶条切下共16条（编号1～6）进行回收，扩增区域：16S，克隆测序结果见表2。由表2可知，菌种Chlorobium limicola strain DSM 245，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677，Magnetospirillum bellicus strain VDY，Rhodoblastus acidophilus strain DSM 137，Clostridium saccharobutylicum strain NCP 262的相似性均為100%，说明这些菌种是3个样品共有的菌种，而其中Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677菌属相似度为100%，条带占比100%，说明该菌种是3个样品的优势菌种。Chondromyces Robustus strain Cm a13，Chloroba culum parvum NCIB 8327，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Thiomonas perometabolis strain ATCC 23370、Dyella thiooxydans strain ATSB10菌种的数目也较多，且在3个样品中也基本都有。
2.2高通量测序结果
通过PCR-DGGE分析结果可知，6个样品均具有较好的代表性。同时也为了节约测序成本，采用编号1-1样品代表样品1，编号2-1代表样品2，3-1代表样品3来开展高通量测序工作。
2.2.1指数分析结果统计。由在指定的相似水平为97%（0.03）的条件下，样品的各多样性指数见表3。由表3可知，样品2-1的OTU序列数最高，1-3最低，而3个样品中1-1的优化序列划分得到的OTU数目最多，为1 566。由此可知，1-1和3-1样品的物种总数较多，样品3-1的香农指数最高，为3.48。各样品文库的覆盖率均在98%以上，样本中序列没有被测出的概率较低，覆盖较深，可见该次测序结果能够充分代表样本的真实情况。
2.2.2稀释性曲线。图6是在97%相似水平下划分OUT并绘制出的各样品稀释曲线。知以看出，3个样品的曲线趋向平坦，说明这3个样品的取样数量合理，取样深度足够，能够代表样品的真实情况。
2.2.3各样本间在门分类水平的比较。
在门分类水平上，根据各样品中微生物组成绘制柱状图，比较各样本在门分类水平上群落结构组成的差异，结果见图7。由图7可知，1-1、1-2样品在门水平上群落结构比较相似，与1-3样品中群落结构略有差距，这与DGGE测序得出的结果一致。主要体现在1-1、1-2样品群落结构中，绿菌门（Chlorobi）数目占的比例最大，变形菌门（Proteobacteria）次之，而1-3样品中变形菌门最多，其次是绿菌门。在拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）等菌门上，差距不明显。
2.2.4热图（Heatmap）。
Heatmap 可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行聚类，将聚类后的数据表示在heatmap图上，通过颜色的梯度及相似程度来反映数据的相似性和差异性。
图8是根据属水平上OTU中所含序列的数量位于前50的信息进行绘制，分别按照样品和分类进行聚类后做出Heatmap图，能够反映出样品在属水平上表现的相似性或者差异性。
由图8可知，3个样品的菌落结构在菌属水平上非常相似，红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、绿棒菌属（Chlorobaculum）、红芽生菌属（Rhodoblastus）、芽生绿菌属（Blastochloris）、气单胞菌属（Aeromonas）是这3个样品共同的优势菌属，其中绿棒菌属在所有的菌属中丰度最大，而此菌属一般为光能无机自养型，专性厌氧，在无氧、有光照的水体中生长。说明试验装置中溶解氧浓度非常低，厌氧环境好。同时反应装置由有机玻璃制成，透明，光照条件好，有利于这些菌属的生长。
3结论
（1）该研究结果表明，DGGE测序与高通量测序结论基本一致。而DGGE测序只能检测到主要的微生物，如果总量占1%以下，便不能被检测到，高通量测序样品检测到26门35纲55目85科153属，说明DGGE显著低估了微生物的群落组成。通过对比这两种测序方法可知，高通量测序的检测灵敏度是DGGE的4～39倍，若进一步分析样品主要微生物类群的相对丰度，发现分类水平越低，高通量测序与DGGE的结果差异越大，尤其在科和属的水平上差异最大[22]。并且高通量测序能够较为全面和准确的反映微生物群落结构，而DGGE仅能够反映有限的优势微生物类群，在很大程度上极可能低估微生物的物种组成并高估其丰度。
（2）以丝瓜络作为反硝化滤池的填料，通过高通量测序以及基于PCR-DGGE技术的环境微生物群落多样性分析，初步得出：优势菌属为红假单胞菌属、绿棒菌属、红芽生菌属、芽生绿菌属、气单胞菌属。
丝瓜络作为反硝化滤池填料时，微生物生长状况良好，表面微生物比较丰富，初步认为丝瓜络可以作为反硝化生物滤池的填料。
参考文献
[1]
李魁晓，白雪，李鑫玮，等.城市污水厂二级处理出水深度处理组合工艺研究[J].环境工程学报，2012，6（1）：63-67.
[2] 刘相超，周政辉，宋献方，等.梁滩河地表水与地下水水化学及硝酸盐污染[J].重庆交通大学学报（自然科学版），2009，28（5）： 942-947.
[3] KIM R H，LEE J，CHANG H W.Characteristics of organic matter as indicators of pollution from smallscale livestock and nitrate contamination of shallow groundwater in an agricultural area[J].Hydrological processes，2003，17（12）：2485-2496.