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摘要[目的]建立凝胶渗透色谱（GPC）-气相色谱法测定蔬菜中抑菌灵残留量的方法。[方法]样品用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取，GPC净化，气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）检测。[结果]抑菌灵在0.01～1.00 mg/L时线性关系良好（R2=0.999 3），方法检测限（S/N=3）为0.32 μg/kg。在0.01、0.02、0.04 mg/kg添加水平下，加标回收率为74.7%～95.7%，相对标准偏差（n=6）为05%～3.5%。[结论]该方法适用于蔬菜中抑菌灵残留量的测定。
关键词凝胶渗透色谱-气相色谱法；抑菌灵；蔬菜；残留
中图分类号TS207.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0079-03
Abstract[Objective] A method for determination of dichlofluanid residue in vegetables by gel permeation chromatography and gas chromatopraphy was developed. [Method] Samples were extracted with cyclohexaneethyl acetate （1∶1， V/V）， and then detected by GCECD after being cleaned up with GPC. [Result] It turned out that dichlofluanid showed a good linearity over the range of 0.01-1.00 mg/L with correlation coefficient of 0.999 3. The limit of detection （LOD） was 0.32 μg/kg. The recoveries of the dichlofluanid were in the range of 74.7%-95.7% with the spiked levels of 0.01， 0.02 and 0.04 mg/kg， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 05%-3.5%. [Conclusion] The method is suitable for detecting dichlofluanid residue in many kinds of vegetables.
Key wordsGel permeation chromatographygas chromatography；Dichlofluanid；Vegetable；Residue
基金項目重慶市青年科技人才培养计划项目（cstc2014kjrc-qnrc00002）；国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2016IK296）；重庆市应用开发重点项目（cstc201yykfB0165）。
作者简介高小丽 （1979—），女，重庆人，讲师，硕士，从事分析化学研究。*通讯作者，高级工程师，从事食品分析和纳米材料研究。
收稿日期2017-04-12
抑菌灵（dichlofluanid，又名苯氟磺胺）是一种广谱保护性杀菌剂，白色粉末，不溶于水，在甲醇中溶解度为15 g/L，二甲苯中溶解度为70 g/L，剂型为可湿性粉剂及粉剂，适用于防治多种蔬菜作物灰霉病、白粉病、霜霉病及真菌性等病害，用作喷雾时，具有杀灭红蜘蛛的作用。该试剂具有一定毒性，雄大鼠口服半数致死量（LD）为2 500 mg/kg，人体日容许摄入量为0.3 mg/kg，应在蔬菜收获前7～14 d停止用药。目前，许多发达国家已对抑菌灵进行了严格限制，例如日本对谷物中抑菌灵的残留限量为0.1 mg/kg[1]。截至目前，我国尚未对抑菌灵残留量进行限量规定。抑菌灵残留量的检测多采用气相色谱法（GC）[2-3]、气相色谱质谱法（GC-MS）[4-9]，前处理方法主要采用固相萃取[10]。该研究通过凝胶渗透色谱（GPC）净化，能够有效除去色素[11-13]，且采用灵敏度高的气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）[14-15]进行测定，建立了一种简便、准确度高、覆盖基质范围广的抑菌灵残留检测方法。
1材料与方法
1.1材料
Agilent 7890A气相色谱仪，配有电子捕获检测器，美国Agilent公司；凝胶渗透色谱仪，美国Lab Tech公司；凝胶净化柱（20 mm×300 mm），填料为S-X3；3-30K台式高速冷冻离心机，德国 Sigma公司；4011 Digital旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；移液器：0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 mL，德国Eppendorf公司；BS224S型天平，德国Sartorius公司；涡旋振荡混合器，江苏康健医疗用品有限公司；匀质仪，荷兰Philips公司。
抑菌灵标准品（纯度为99.6%），美国Sigma公司；环己烷、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈（色谱纯），美国Tedia公司；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯）。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。
准确称取适量的抑菌灵标准物质，正己烷溶解，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备溶液，正己烷逐级稀释成0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的标准工作溶液。
1.2.2色谱条件。
色谱柱：DB-1701石英毛细管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯N2；柱流速1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；进样方式为不分流进样，恒流；柱温程序：初始温度150 ℃（保持1 min），以30 ℃/min升至280 ℃（保持20 min）；进样量为2.0 μL；检测器温度300 ℃。 1.2.3样品前处理。
称取10.0 g蔬菜匀浆于50 mL离心管中，加20 mL的环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液，水平振荡10 min，加3.5 g氯化钠和3.5 g无水硫酸镁，涡旋混匀，5 000 r/min离心3 min，取10 mL有机相，过0.4 μm滤膜，取5.0 mL过GPC柱净化，以环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）为淋洗液，淋洗速度为5.0 mL/min，弃去45 mL流出液后，收集55 mL淋洗液。转入旋转蒸发瓶，在低于40 ℃的水浴中浓缩至近干，用正己烷溶解残余物，并定容至2.0 mL，涡旋混匀。经0.22 μm滤膜过滤后，供GC-ECD测定。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
分别采用乙腈、正己烷、正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取样品中的抑菌灵，进行回收率试验，以选取合适的提取溶剂。结果如图1所示，乙腈和正己烷的提取回收率相对偏低，丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）以及环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的提取回收率相对于正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）較高，考虑到丙酮提取杂质较多，且采用丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取需先将提取液浓缩，用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）定容之后，再经GPC净化，故该研究采用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作为提取溶剂。
2.2 GPC收集时间段的选择
取1.00 mg/L的标准工作溶液0.1 mL，用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）定容至10.0 mL，涡旋混匀，取 5.0 mL过GPC，对0～7、7～9、9～19、19～23 min的淋洗液进行收集，将各个时间段的淋洗液在低于40 ℃的水浴中旋转浓缩至近干，用正己烷定容至2.0 mL，涡旋混匀。经0.22 μm滤膜过滤后，供GC-ECD测定。由图2可知，应对9～19 min的淋洗液进行收集。
2.3不同净化方法的选择
结合抑菌灵和被测样品基质的性质，以白菜为基质，考察了基质分散固相萃取、氨基柱固相萃取以及GPC 3种净化方式。虽然固相萃取小柱能够净化基质中的杂质，但其回收率过低，在基质分散固相萃取净化中对石墨化碳黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）进行了考察，使用GCB净化时才能够有效去除色素，但是回收率仅能达到64.2%；石墨化碳氨基复合柱萃取的回收率仅为40.6%，GPC不仅能够净化基质的杂质，而且其回收率（875%）能够满足要求。
2.4线性范围及检测限
对0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、050、1.00 mg/L系列质量浓度的抑菌灵标准溶液进行测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X，mg/L）绘制标准曲线，得到线性方程Y=1 272.1X-15 145，R2=0.999 3，表明在0.01～1.00 mg/L有良好的线性关系。以S/N=3计算，方法检测限为0.32 μg/kg。
2.5准确度和精密度
方法的准确度以回收率表示，精密度用相对标准偏差表示。分别对甘蓝（叶菜类）、西红柿（茄果类）、白萝卜（根茎类）、黄瓜（瓜类）、豆芽（豆类）等以001、0.02、0.04 mg/kg添加浓度水平分别进行添加回收，每个水平重复6次，外标法定量，试验结果见表1。
3 结论
该试验建立了凝胶渗透色谱-气相色谱法测定蔬菜中抑菌灵残留量的方法，并优化了试验条件，确定了提取溶剂、淋洗液的收集时间段等参数。该方法具有简单、准确度高、重现性好、基质适用范围广等优点。目前我国还未对蔬菜中的抑菌灵进行限量规定，该方法为蔬菜中抑菌灵的检测提供了技术支持，特别适合于在食品检测实验室推广应用。
参考文献
[1] SHAO D L.Determination of dichlofluanid residue in soybean by capillary collumns gas chromatography[J].Agricultural science & technology，2010，11（3）：7-8，64.
[2] CABRAS P，TUBEROSO C，MELIS M，et al.Multiresidue method for pesticide determination in wine by high-performance liquid chromatography[J].Journal of agriculture and food chemistry，1992，40（5）：817-819.
[3] 中華人民共和国国家进出口商品检验局.出口谷粮中抑菌灵残留量检测方法：SN 0491—1995[S].北京：中国标准出版社，1995.
[4] 国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中百菌清、苯氟磺胺、甲抑菌灵、克菌灵、灭菌丹、敌菌丹和四溴菊酯残留量检测方法 气相色谱-质谱法：SN/T 2320—2009[S].北京：中国标准出版社，2009.
[5] ALBERO B，SNCHEZ-BRUNETE C，TADEO J L.Analysis of pesticide in honey by solidphase extraction and gas chromatographymass spectrometry[J].Journal of agriculture and food chemistry，2004，52（19）：5828-5835.
[6] SENZ B C，SANZ A J，PLAZA M M，et al.Evaluation of the decay of malathion，dichlofluanid and fenitrothion pesticides in apple samples，using gas chromatography[J].Food chemistry，1995，52（3）：305-309.
[7] 刘瑜，蒋施，徐宜宏，等.气相色谱-串联质谱法测定葱、姜、蒜中120种农药残留量[J].化学通报，2012，75（12）：1132-1139.
[8] 周长民，徐宜宏，张侃，等.气相色谱-三重四级杆串联质谱法测定圆葱中134种农药的多残留[J].福建分析测试，2014，23（4）：5-15.
[9] 刘小勤，佟玲，孟文婷，等.气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定白芍中 99种农药残留[J].色谱，2015，33（8）：869-877.
[10] 王玉健，黄惠玲，卓海华，等.固相萃取技术在农药残留分析中的应用[J].检验检疫学刊，2009，19（2）：74-76.
[11] 李伟，许华，常宇文.凝胶渗透色谱净化-气象色谱法测定蔬菜中百菌清残留[J].现代仪器，2006，12（6）：68-70.
[12] 杨慧琴，郭德华，李波，等.在线凝胶色谱串联气相色谱-质谱对食品中七种杀菌剂残留量的测定[J].分析测试学报，2008，27（S1）：141-142.
[13] 缪琪.凝胶渗透色谱法在果蔬农残分析中的应用[D].兰州：甘肃农业大学，2007.
[14] 张潜，高玲，赖发伟，等.电子捕获检测器-气象色谱法测定饮用水中多种有机磷残留[J].现代预防医学，2007，34（14）：2714-2717.
[15] 赵杰，梁永明.电子捕获检测器测定粮食中三唑酮残留量[J].粮食与食品工业，2009，16（6）：51-52.
关键词凝胶渗透色谱-气相色谱法；抑菌灵；蔬菜；残留
中图分类号TS207.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0079-03
Abstract[Objective] A method for determination of dichlofluanid residue in vegetables by gel permeation chromatography and gas chromatopraphy was developed. [Method] Samples were extracted with cyclohexaneethyl acetate （1∶1， V/V）， and then detected by GCECD after being cleaned up with GPC. [Result] It turned out that dichlofluanid showed a good linearity over the range of 0.01-1.00 mg/L with correlation coefficient of 0.999 3. The limit of detection （LOD） was 0.32 μg/kg. The recoveries of the dichlofluanid were in the range of 74.7%-95.7% with the spiked levels of 0.01， 0.02 and 0.04 mg/kg， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 05%-3.5%. [Conclusion] The method is suitable for detecting dichlofluanid residue in many kinds of vegetables.
Key wordsGel permeation chromatographygas chromatography；Dichlofluanid；Vegetable；Residue
基金項目重慶市青年科技人才培养计划项目（cstc2014kjrc-qnrc00002）；国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2016IK296）；重庆市应用开发重点项目（cstc201yykfB0165）。
作者简介高小丽 （1979—），女，重庆人，讲师，硕士，从事分析化学研究。*通讯作者，高级工程师，从事食品分析和纳米材料研究。
收稿日期2017-04-12
抑菌灵（dichlofluanid，又名苯氟磺胺）是一种广谱保护性杀菌剂，白色粉末，不溶于水，在甲醇中溶解度为15 g/L，二甲苯中溶解度为70 g/L，剂型为可湿性粉剂及粉剂，适用于防治多种蔬菜作物灰霉病、白粉病、霜霉病及真菌性等病害，用作喷雾时，具有杀灭红蜘蛛的作用。该试剂具有一定毒性，雄大鼠口服半数致死量（LD）为2 500 mg/kg，人体日容许摄入量为0.3 mg/kg，应在蔬菜收获前7～14 d停止用药。目前，许多发达国家已对抑菌灵进行了严格限制，例如日本对谷物中抑菌灵的残留限量为0.1 mg/kg[1]。截至目前，我国尚未对抑菌灵残留量进行限量规定。抑菌灵残留量的检测多采用气相色谱法（GC）[2-3]、气相色谱质谱法（GC-MS）[4-9]，前处理方法主要采用固相萃取[10]。该研究通过凝胶渗透色谱（GPC）净化，能够有效除去色素[11-13]，且采用灵敏度高的气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）[14-15]进行测定，建立了一种简便、准确度高、覆盖基质范围广的抑菌灵残留检测方法。
1材料与方法
1.1材料
Agilent 7890A气相色谱仪，配有电子捕获检测器，美国Agilent公司；凝胶渗透色谱仪，美国Lab Tech公司；凝胶净化柱（20 mm×300 mm），填料为S-X3；3-30K台式高速冷冻离心机，德国 Sigma公司；4011 Digital旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；移液器：0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 mL，德国Eppendorf公司；BS224S型天平，德国Sartorius公司；涡旋振荡混合器，江苏康健医疗用品有限公司；匀质仪，荷兰Philips公司。
抑菌灵标准品（纯度为99.6%），美国Sigma公司；环己烷、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈（色谱纯），美国Tedia公司；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯）。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。
准确称取适量的抑菌灵标准物质，正己烷溶解，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备溶液，正己烷逐级稀释成0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的标准工作溶液。
1.2.2色谱条件。
色谱柱：DB-1701石英毛细管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯N2；柱流速1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；进样方式为不分流进样，恒流；柱温程序：初始温度150 ℃（保持1 min），以30 ℃/min升至280 ℃（保持20 min）；进样量为2.0 μL；检测器温度300 ℃。 1.2.3样品前处理。
称取10.0 g蔬菜匀浆于50 mL离心管中，加20 mL的环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液，水平振荡10 min，加3.5 g氯化钠和3.5 g无水硫酸镁，涡旋混匀，5 000 r/min离心3 min，取10 mL有机相，过0.4 μm滤膜，取5.0 mL过GPC柱净化，以环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）为淋洗液，淋洗速度为5.0 mL/min，弃去45 mL流出液后，收集55 mL淋洗液。转入旋转蒸发瓶，在低于40 ℃的水浴中浓缩至近干，用正己烷溶解残余物，并定容至2.0 mL，涡旋混匀。经0.22 μm滤膜过滤后，供GC-ECD测定。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
分别采用乙腈、正己烷、正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取样品中的抑菌灵，进行回收率试验，以选取合适的提取溶剂。结果如图1所示，乙腈和正己烷的提取回收率相对偏低，丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）以及环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的提取回收率相对于正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）較高，考虑到丙酮提取杂质较多，且采用丙酮-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取需先将提取液浓缩，用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）定容之后，再经GPC净化，故该研究采用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作为提取溶剂。
2.2 GPC收集时间段的选择
取1.00 mg/L的标准工作溶液0.1 mL，用环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）定容至10.0 mL，涡旋混匀，取 5.0 mL过GPC，对0～7、7～9、9～19、19～23 min的淋洗液进行收集，将各个时间段的淋洗液在低于40 ℃的水浴中旋转浓缩至近干，用正己烷定容至2.0 mL，涡旋混匀。经0.22 μm滤膜过滤后，供GC-ECD测定。由图2可知，应对9～19 min的淋洗液进行收集。
2.3不同净化方法的选择
结合抑菌灵和被测样品基质的性质，以白菜为基质，考察了基质分散固相萃取、氨基柱固相萃取以及GPC 3种净化方式。虽然固相萃取小柱能够净化基质中的杂质，但其回收率过低，在基质分散固相萃取净化中对石墨化碳黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）进行了考察，使用GCB净化时才能够有效去除色素，但是回收率仅能达到64.2%；石墨化碳氨基复合柱萃取的回收率仅为40.6%，GPC不仅能够净化基质的杂质，而且其回收率（875%）能够满足要求。
2.4线性范围及检测限
对0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、050、1.00 mg/L系列质量浓度的抑菌灵标准溶液进行测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X，mg/L）绘制标准曲线，得到线性方程Y=1 272.1X-15 145，R2=0.999 3，表明在0.01～1.00 mg/L有良好的线性关系。以S/N=3计算，方法检测限为0.32 μg/kg。
2.5准确度和精密度
方法的准确度以回收率表示，精密度用相对标准偏差表示。分别对甘蓝（叶菜类）、西红柿（茄果类）、白萝卜（根茎类）、黄瓜（瓜类）、豆芽（豆类）等以001、0.02、0.04 mg/kg添加浓度水平分别进行添加回收，每个水平重复6次，外标法定量，试验结果见表1。
3 结论
该试验建立了凝胶渗透色谱-气相色谱法测定蔬菜中抑菌灵残留量的方法，并优化了试验条件，确定了提取溶剂、淋洗液的收集时间段等参数。该方法具有简单、准确度高、重现性好、基质适用范围广等优点。目前我国还未对蔬菜中的抑菌灵进行限量规定，该方法为蔬菜中抑菌灵的检测提供了技术支持，特别适合于在食品检测实验室推广应用。
参考文献
[1] SHAO D L.Determination of dichlofluanid residue in soybean by capillary collumns gas chromatography[J].Agricultural science & technology，2010，11（3）：7-8，64.
[2] CABRAS P，TUBEROSO C，MELIS M，et al.Multiresidue method for pesticide determination in wine by high-performance liquid chromatography[J].Journal of agriculture and food chemistry，1992，40（5）：817-819.
[3] 中華人民共和国国家进出口商品检验局.出口谷粮中抑菌灵残留量检测方法：SN 0491—1995[S].北京：中国标准出版社，1995.
[4] 国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中百菌清、苯氟磺胺、甲抑菌灵、克菌灵、灭菌丹、敌菌丹和四溴菊酯残留量检测方法 气相色谱-质谱法：SN/T 2320—2009[S].北京：中国标准出版社，2009.
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[6] SENZ B C，SANZ A J，PLAZA M M，et al.Evaluation of the decay of malathion，dichlofluanid and fenitrothion pesticides in apple samples，using gas chromatography[J].Food chemistry，1995，52（3）：305-309.
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[8] 周长民，徐宜宏，张侃，等.气相色谱-三重四级杆串联质谱法测定圆葱中134种农药的多残留[J].福建分析测试，2014，23（4）：5-15.
[9] 刘小勤，佟玲，孟文婷，等.气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定白芍中 99种农药残留[J].色谱，2015，33（8）：869-877.
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[12] 杨慧琴，郭德华，李波，等.在线凝胶色谱串联气相色谱-质谱对食品中七种杀菌剂残留量的测定[J].分析测试学报，2008，27（S1）：141-142.
[13] 缪琪.凝胶渗透色谱法在果蔬农残分析中的应用[D].兰州：甘肃农业大学，2007.
[14] 张潜，高玲，赖发伟，等.电子捕获检测器-气象色谱法测定饮用水中多种有机磷残留[J].现代预防医学，2007，34（14）：2714-2717.
[15] 赵杰，梁永明.电子捕获检测器测定粮食中三唑酮残留量[J].粮食与食品工业，2009，16（6）：51-52.