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摘要：目的 探讨丹参酮ⅡA对低氧培养的人高转移性巨细胞肺癌（PG）细胞表面黏附分子E-cadherin、β1-整合素表达的影响。方法 PG细胞复苏，按干预药物不同分为丹参酮ⅡA高、中、低剂量组及顺铂组、阴性对照组，分别置于常氧和低氧环境下培养，48 h后应用流式细胞术测定黏附分子E-cadherin、β1-整合素在各组PG细胞表面表达情况。结果 低氧环境下，PG细胞所表达β1-整合素荧光强度随丹参酮ⅡA浓度的增高而逐渐减弱，但表达β1-整合素的阳性细胞率接近100%，无统计学意义；PG细胞表达E-cadherin，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，其阳性细胞数增加，但表达E-cadherin的荧光强度很弱，无统计学意义。常氧环境下，PG细胞所表达β1-整合素的荧光强度随着丹参酮ⅡA浓度的增高逐渐减弱，表达β1-整合素的阳性细胞率接近100%，无统计学意义；PG细胞表达E-cadherin，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，其阳性细胞数减少，但表达E-cadherin荧光强度很弱，没有统计学意义。结论 在常氧环境下，丹参酮ⅡA通过下调E-cadherin和β1-整合素表达来抑制PG细胞的浸润转移；在低氧环境下，通过下调β1-整合素来抑制PG细胞的转移而上调E-cadherin表达来增加PG细胞的浸润转移能力。
关键词：人高转移性巨细胞肺癌细胞；丹参酮ⅡA；β1-整合素；黏附分子
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0039-03
近年来的研究表明，丹参的有效成分主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异丹参酮Ⅰ等15种，其中丹参酮ⅡA（TANⅡA）的抗肿瘤作用比较明确[1]，其对实体瘤有效抑制率可达52.80%[2]，TANⅡA对体外培养的多种肿瘤细胞具有明显抑制作用[3]。1996年Brizel等[4]首次证明人类肿瘤细胞远处转移与肿瘤低氧微环境有密切相关性，低氧引起肿瘤细胞发生细胞代谢、基因表达及基因表型、蛋白合成等[5-7]一系列生物学特征改变，使肿瘤细胞更具侵袭性，容易发生远处转移。本研究利用TANⅡA分别干预常氧、低氧微环境下生长的人高转移性巨细胞肺癌（PG）细胞，然后应用流式细胞术检测PG细胞表面β1-整合素（CD29）及黏附分子E-cadherin（CD324）表达的变化。
1 实验材料
1.1 细胞株
PG细胞株，中国中医科学院广安门医院肿瘤实验室提供。
1.2 主要药物、试剂及仪器
RPMI 1640培养基：GIBCO产品；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）：Amresco产品；TANⅡA：中国药品生物制品检定所提供，批号110766-200619，用终浓度为0.02%的二甲基亚砜（DMSO）溶解（DMSO≤0.1%时，不引起细胞生物学性状的改变），4 ℃避光保存；顺铂（DDP）：云南个旧生物药业有限公司，批号H53021740；PE anti-human CD324 （E-Cadherin）：美国Biolegend；PE Mouse IgG1，κIsotype Ctrl（FC）：美国Biolegend；PE Mouse Anti-Human CD29：美国BD；PE Mouse IgG2a，κIsotype Control：美国Milipore。低氧工作站INVIVO2 200：英国RUSKINN公司；流式细胞仪：美国BD公司，FACS Calibur分析型。
5 讨论
整合素家族在结构上是由α亚单位和β亚单位通过非共价键连接而成的一类异二聚体跨膜黏蛋白，现在已发现至少有19种α亚单位和8种β亚单位，不同数量的亚单位结合形成约24种整联蛋白分子。在功能上主要介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附作用。而β整合素中以CD29整合素和β3与肺癌转移关系尤为密切。它们介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附反应，并且参与细胞信号传递，细胞迁移，控制细胞分化、增殖及调节等各个生理过程[8]。CD29主要介导细胞-细胞外基质的相互作用，它是多种细胞外基质蛋白的受体。Xu等[9]报告CD29抗体有明显抑制几种人肺癌细胞的黏附作用，证明了CD29在人肺癌细胞黏附到基底膜过程中是不可缺少的。Yasuda等[10]研究发现刺激CD29能降低同质性肺癌细胞上的细胞黏附分子-1表达，使同质性肺癌细胞间黏附能力下降，有利于其进入血流后形成细胞团，抵御免疫细胞的杀伤。鞠氏等[11]研究发现上调CD29表达可明显提高肺癌细胞黏附和迁移能力。本实验研究发现，TANⅡA分别能在常氧和低氧的环境下随着其浓度的升高，降低PG细胞表面CD29的表达，从而可能有抑制PG细胞转移的作用，TANⅡA浓度为24 μg/mL时效果最明显，这与现在多项体外实验研究证明TANⅡA能抑制肿瘤转移相符。
CD324对促进细胞的黏附、聚集、维持细胞极性、维持上皮形态结构的完整性及参与分化调节也有至关重要的作用， CD324表达下降或者不表达提示肿瘤有更高的侵袭能力。CD324表达的缺失与人类肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的浸润转移密切相关[12]。Frixen等[13]研究发现侵袭力强的肿瘤细胞中无CD324表达，将CD324 cDNA转染到该肿瘤细胞株，其黏附功能得以恢复，阻止了其浸润转移能力，表明CD324有抑制肿瘤浸润转移的功能。Jawhari等[14]研究也表明细胞丧失CD324会获得浸润能力。本研究显示，适度的缺氧可直接明显增加肿瘤细胞增殖，并有利于细胞的侵袭。在常氧环境下，随着TANⅡA药物浓度的增加其表达值也在增加，表明PG细胞的浸润转移能力随着TANⅡA药物浓度的增加在减弱，在TANⅡA药物浓度为24 μg/mL时，PG细胞的浸润转移能力减到最低；然而在低氧环境中，随着TANⅡA药物浓度的增加其表达值在减少，表明PG细胞的浸润转移能力随着TANⅡA药物浓度的增加也在增加，在TANⅡA药物浓度为24 μg/mL时，PG细胞的浸润转移能力增加到最大。结合TANⅡA对不同氧环境下PG细胞表面CD29及CD324表达的影响，我们发现，在常氧环境下，TANⅡA通过下调CD324、CD29表达来抑制PG细胞的浸润转移；在低氧环境下，通过下调CD29来抑制PG细胞的转移而上调CD324表达来增加PG细胞的浸润转移能力，因此关于其作用的机制及其靶点还需要更加深入的研究。 参考文献：
[1] Georgoulias V， Ardavanis A， Agelidou A， et al. Docetaxel versus docetaxel plus cisplatin as front line treatment of patients with advanced non small cell lung cancer：a randomized， multicenter phase Ⅲ trial[J]. J Clin Oncol，2004，22：2602-2609.
[2] 卢岩，康健.丹参酮ⅡA抗肿瘤的作用机制的研究[J].辽宁医药杂志， 2009，20（9）：98-101.
[3] 袁淑兰，王修杰.丹参酮抗肿瘤作用及其机理的研究[J].癌症，2003， 22（12）：1363-1366.
[4] Brizel DM， Scully SP， Harrelson JM， et al. Tumor oxygenation predicts for the likelihood of distant metastases in human soft tissue sarcoma[J]. Cancer Res，1996，56：941-943.
[5] Laconi E. The evolving concept of tumor microenvironments[J] Bioessays，2007，29（8）：738-744.
[6] Le QT， Denko NC， Giaccia AJ. Hypoxic gene expression and metastasis[J]. Cancer Metastasis Rev，2004，23（3/4）：293-310.
[7] Brahimi-Horn MC， Chiche J， Pouysségur J. Hypoxia and cancer[J]. J Mol Med，2007，85（12）：1301-1307.
[8] Vander Filer A， Sonnenberg A. Function and interaction of integrins[J]. Cell Tissue Res， 2001，305（3）：285-290.
[9] Xu Z， Ma DZ， Wang LY， et al. Transforming growth factor-beta1 stimulated protein kinase B serine-473 and focal adhesion kinase tyrosine phosphorylation dependent on cell adhesion in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，312（2）：388.
[10] Yasuda M， Tanaka Y， Tamura M， et al. Stimulation of beta1 integrin down-regulates ICAM-1 expression and ICAM-1-dependent adhesion of lung cancer cells through focal adhesion kinase[J]. Cancer Res，2001，61（5）：2022-2030.
[11] 鞠立霞，周彩存.整合素β1表达上调对肺癌细胞迁移和黏附能力的影响[J].现代生物医学进展，2009，20（9）：3807-3810.
[12] 刘卫国，文明星，吕新生.上皮钙黏附素系统在肿瘤中的意义及其调控[J].国外医学：生理病理科学与临床分册，1999，16（3）：241.
[13] Frixen UH， B ehrens J， Sachs M， et al. E-cadherin mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells[J]. J Cell Biol，1991，113：173-185.
[14] Jawhari A， Jordan S， Poole S， et al. Abnormal immunoreactivity of the E-Cadherin catenin complex in gastric carcinoma：relationship with patient survival[J]. Gastroenterology，1997， 112（1）：46-54.
（收稿日期：2011-07-19，编辑：华强）
关键词：人高转移性巨细胞肺癌细胞；丹参酮ⅡA；β1-整合素；黏附分子
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0039-03
近年来的研究表明，丹参的有效成分主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异丹参酮Ⅰ等15种，其中丹参酮ⅡA（TANⅡA）的抗肿瘤作用比较明确[1]，其对实体瘤有效抑制率可达52.80%[2]，TANⅡA对体外培养的多种肿瘤细胞具有明显抑制作用[3]。1996年Brizel等[4]首次证明人类肿瘤细胞远处转移与肿瘤低氧微环境有密切相关性，低氧引起肿瘤细胞发生细胞代谢、基因表达及基因表型、蛋白合成等[5-7]一系列生物学特征改变，使肿瘤细胞更具侵袭性，容易发生远处转移。本研究利用TANⅡA分别干预常氧、低氧微环境下生长的人高转移性巨细胞肺癌（PG）细胞，然后应用流式细胞术检测PG细胞表面β1-整合素（CD29）及黏附分子E-cadherin（CD324）表达的变化。
1 实验材料
1.1 细胞株
PG细胞株，中国中医科学院广安门医院肿瘤实验室提供。
1.2 主要药物、试剂及仪器
RPMI 1640培养基：GIBCO产品；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）：Amresco产品；TANⅡA：中国药品生物制品检定所提供，批号110766-200619，用终浓度为0.02%的二甲基亚砜（DMSO）溶解（DMSO≤0.1%时，不引起细胞生物学性状的改变），4 ℃避光保存；顺铂（DDP）：云南个旧生物药业有限公司，批号H53021740；PE anti-human CD324 （E-Cadherin）：美国Biolegend；PE Mouse IgG1，κIsotype Ctrl（FC）：美国Biolegend；PE Mouse Anti-Human CD29：美国BD；PE Mouse IgG2a，κIsotype Control：美国Milipore。低氧工作站INVIVO2 200：英国RUSKINN公司；流式细胞仪：美国BD公司，FACS Calibur分析型。
5 讨论
整合素家族在结构上是由α亚单位和β亚单位通过非共价键连接而成的一类异二聚体跨膜黏蛋白，现在已发现至少有19种α亚单位和8种β亚单位，不同数量的亚单位结合形成约24种整联蛋白分子。在功能上主要介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附作用。而β整合素中以CD29整合素和β3与肺癌转移关系尤为密切。它们介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附反应，并且参与细胞信号传递，细胞迁移，控制细胞分化、增殖及调节等各个生理过程[8]。CD29主要介导细胞-细胞外基质的相互作用，它是多种细胞外基质蛋白的受体。Xu等[9]报告CD29抗体有明显抑制几种人肺癌细胞的黏附作用，证明了CD29在人肺癌细胞黏附到基底膜过程中是不可缺少的。Yasuda等[10]研究发现刺激CD29能降低同质性肺癌细胞上的细胞黏附分子-1表达，使同质性肺癌细胞间黏附能力下降，有利于其进入血流后形成细胞团，抵御免疫细胞的杀伤。鞠氏等[11]研究发现上调CD29表达可明显提高肺癌细胞黏附和迁移能力。本实验研究发现，TANⅡA分别能在常氧和低氧的环境下随着其浓度的升高，降低PG细胞表面CD29的表达，从而可能有抑制PG细胞转移的作用，TANⅡA浓度为24 μg/mL时效果最明显，这与现在多项体外实验研究证明TANⅡA能抑制肿瘤转移相符。
CD324对促进细胞的黏附、聚集、维持细胞极性、维持上皮形态结构的完整性及参与分化调节也有至关重要的作用， CD324表达下降或者不表达提示肿瘤有更高的侵袭能力。CD324表达的缺失与人类肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的浸润转移密切相关[12]。Frixen等[13]研究发现侵袭力强的肿瘤细胞中无CD324表达，将CD324 cDNA转染到该肿瘤细胞株，其黏附功能得以恢复，阻止了其浸润转移能力，表明CD324有抑制肿瘤浸润转移的功能。Jawhari等[14]研究也表明细胞丧失CD324会获得浸润能力。本研究显示，适度的缺氧可直接明显增加肿瘤细胞增殖，并有利于细胞的侵袭。在常氧环境下，随着TANⅡA药物浓度的增加其表达值也在增加，表明PG细胞的浸润转移能力随着TANⅡA药物浓度的增加在减弱，在TANⅡA药物浓度为24 μg/mL时，PG细胞的浸润转移能力减到最低；然而在低氧环境中，随着TANⅡA药物浓度的增加其表达值在减少，表明PG细胞的浸润转移能力随着TANⅡA药物浓度的增加也在增加，在TANⅡA药物浓度为24 μg/mL时，PG细胞的浸润转移能力增加到最大。结合TANⅡA对不同氧环境下PG细胞表面CD29及CD324表达的影响，我们发现，在常氧环境下，TANⅡA通过下调CD324、CD29表达来抑制PG细胞的浸润转移；在低氧环境下，通过下调CD29来抑制PG细胞的转移而上调CD324表达来增加PG细胞的浸润转移能力，因此关于其作用的机制及其靶点还需要更加深入的研究。 参考文献：
[1] Georgoulias V， Ardavanis A， Agelidou A， et al. Docetaxel versus docetaxel plus cisplatin as front line treatment of patients with advanced non small cell lung cancer：a randomized， multicenter phase Ⅲ trial[J]. J Clin Oncol，2004，22：2602-2609.
[2] 卢岩，康健.丹参酮ⅡA抗肿瘤的作用机制的研究[J].辽宁医药杂志， 2009，20（9）：98-101.
[3] 袁淑兰，王修杰.丹参酮抗肿瘤作用及其机理的研究[J].癌症，2003， 22（12）：1363-1366.
[4] Brizel DM， Scully SP， Harrelson JM， et al. Tumor oxygenation predicts for the likelihood of distant metastases in human soft tissue sarcoma[J]. Cancer Res，1996，56：941-943.
[5] Laconi E. The evolving concept of tumor microenvironments[J] Bioessays，2007，29（8）：738-744.
[6] Le QT， Denko NC， Giaccia AJ. Hypoxic gene expression and metastasis[J]. Cancer Metastasis Rev，2004，23（3/4）：293-310.
[7] Brahimi-Horn MC， Chiche J， Pouysségur J. Hypoxia and cancer[J]. J Mol Med，2007，85（12）：1301-1307.
[8] Vander Filer A， Sonnenberg A. Function and interaction of integrins[J]. Cell Tissue Res， 2001，305（3）：285-290.
[9] Xu Z， Ma DZ， Wang LY， et al. Transforming growth factor-beta1 stimulated protein kinase B serine-473 and focal adhesion kinase tyrosine phosphorylation dependent on cell adhesion in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，312（2）：388.
[10] Yasuda M， Tanaka Y， Tamura M， et al. Stimulation of beta1 integrin down-regulates ICAM-1 expression and ICAM-1-dependent adhesion of lung cancer cells through focal adhesion kinase[J]. Cancer Res，2001，61（5）：2022-2030.
[11] 鞠立霞，周彩存.整合素β1表达上调对肺癌细胞迁移和黏附能力的影响[J].现代生物医学进展，2009，20（9）：3807-3810.
[12] 刘卫国，文明星，吕新生.上皮钙黏附素系统在肿瘤中的意义及其调控[J].国外医学：生理病理科学与临床分册，1999，16（3）：241.
[13] Frixen UH， B ehrens J， Sachs M， et al. E-cadherin mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells[J]. J Cell Biol，1991，113：173-185.
[14] Jawhari A， Jordan S， Poole S， et al. Abnormal immunoreactivity of the E-Cadherin catenin complex in gastric carcinoma：relationship with patient survival[J]. Gastroenterology，1997， 112（1）：46-54.
（收稿日期：2011-07-19，编辑：华强）