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摘要：Escherichia coli Rosetta菌株是基因克隆表达的重要宿主菌，为了探索裂解E.coli Rosetta菌体的新方法，从污水中分离到1株能裂解E.coli Rosetta菌株的噬菌体，命名为ETP-1，并研究其生物学特性和裂解效率。结果表明，EPT-1在双层平板上形成直径为1～3 mm的噬菌斑；噬菌斑透明，周围有晕环；该噬菌体的潜伏期为20min，裂解期为70 min，在55 ℃以上以及pH值大于11时，噬菌体失去活性。在6 h内，噬菌体可裂解73%的E.coli Rosetta菌体，ETP-1裂解其宿主细胞为E.coli Rosetta菌株菌体的破碎提供了新的方法。
关键词：细胞破碎方法；E.coli Rosetta；噬菌体；裂解效率
中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0061-03
收稿日期：2014-09-16
基金项目：国家自然科学基金（编号：31160035、31260034）。
作者简介：雷琎（1989—），男，云南昆明人，硕士研究生，主要从事噬菌体及其蛋白研究。E-mail：leijin1989@hotmail.com。
通信作者：林连兵，硕士，教授，主要从事高温噬菌体研究。E-mail：570782220@qq.com大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达多种异源蛋白质的首选系统[1]。迄今为止，由大肠杆菌改造而来的基因工程菌已达近百种之多，常用的就有50种左右[2]，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli JM109、E.coli JM110等。常见的大肠杆菌噬菌体也有很多种，如烈性噬菌体中的T4噬菌体、T1噬菌体，温和噬菌体中的λ噬菌体[3]。T4噬菌体常用于噬菌体展示，λ噬菌体常作为克隆表达的载体。实验室中常用E.coli Rosetta作为克隆表达菌株，E.coli Rosetta在E.coli BL21基础上，补充了大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子对应的tRNA，以提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。克隆表达的一般步骤是诱导表达后，直接使用超声破碎细胞。超声破碎是一种相对温和的细胞破碎方法，但是超声破碎时会产生一定的热量，对于一些结构不稳定的目的蛋白，其结构依然会被破坏。本研究以E.coli Rosetta为宿主菌，分离E.coli Rosetta的噬菌体，对其进行感染、裂解，对其生物学特征、裂解效果等进行研究，探索使用噬菌体替代超声破碎细胞的可行性。
1材料与方法
1.1菌种及噬菌体来源
E.coli Rosetta菌株。
1.2主要试剂和仪器
LB培养基、蛋白质电泳系统、恒温摇床、恒温培养箱。
1.3ETP-1的分离
采集生活污水10 mL经5 000 g、15 min离心去除杂质，再经0.22 μm的滤膜滤除细菌，收取滤液，吸取滤液5 mL与过夜培养的E.coli Rosetta 培养液5 mL混匀，于37 ℃、12 h振荡培养。
根据文献[4]的方法，采用双层平板法检测和筛选噬菌体。将上述培养液离心并通过0.22 μm滤膜过滤，取200 μL滤液和200 μL 处于对数期的E.coli Rosetta 菌液混合，静置15 min后，将其加入装有4 mL 0.9%琼脂的预热LB半固体培养基的离心管中，混匀后平铺至LB固体培养基上，37 ℃过夜培养，观察噬菌体的生长情况。若有噬菌斑，挑取单个形态均一噬菌斑。将噬菌斑置于4 mL无菌水的离心管中，37 ℃温浴0.5 h，取100 μL上述噬菌体悬液和宿主做双层平板。重复4～5次可得到纯噬菌体。
1.4ETP-1的电镜观察
取出单个噬菌斑于LB液体培养基中37 ℃过夜培养，用10%的PEG8000在4 ℃下过夜沉淀后，将沉淀溶于SM缓冲液中，再加入CsCl，使其ρ=1.5 g/mL。以36 000 r/min超速离心18 h，抽取噬菌体条带，通过负染后观察。
1.5噬菌体一步生长曲线绘制
按照文献[5]的方法。取一定量的新鲜噬菌体培养液 1 mL （病毒滴度≈107 PFU/mL）与处于对数生长期的E.coli Rosetta 10 mL混合，使得感染复数MOI=0.01，37 ℃温育 10 min。13 000 g离心2 min，弃上清，用30 μL的LB液体培养基洗涤3次，最后用30 μL LB液体培养基悬浮宿主细胞。取60 μL上述细胞到5 mL LB液体培养基，37 ℃ 180 r/min振荡培养100 min，同时开始计时，每隔10 min取100 μL培养液测定噬菌体的滴度。以感染时间为横坐标、滴度的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线，估算出噬菌体的潜伏期、暴发期。
1.6温度对噬菌体活性的影响
按照文献[5]的方法，将噬菌体悬液（将LB液体培养基099 mL和0.01 mL滴度为1×107 PFU/mL的噬菌体悬液混合），分别置于15、25、35、45、55、60 ℃处理1 h，每隔20 min取样，用双层平板测定滴度。试验重复3次，取平均值。
1.7pH值对噬菌体活性的影响
按照文献[5]的方法，将pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液体培养基0.99 mL和0.01 mL滴度为1×107 PFU/mL的噬菌体悬液混合，室温静置1 h，分别用双层平板测定噬菌体滴度。试验重复3次，取平均值。
1.8ETP-1感染E.coli Rosetta对其生长的影响
分别设立试验组和对照组，测定Rosetta的生长曲线，当培养至对数期时（D600 nm≈0.6）加入一定效价的噬菌体悬液体，使MOI=0.01，培养20 h，每隔30 min分别测定D600 nm的数值。以横坐标为时间、纵坐标为D值绘制一条试验组与对照组的Rosetta生长曲线。 1.9ETP-1对E.coli Rosetta裂解效果
准备3组150 mL的液体培养基在恒温摇床中振荡培养E.coli Rosetta，至对数期（D600 nm≈0.6）。分别设立试验组、对照组和空白组，向试验组中加入一定效价的噬菌体，使MOI=0.01，空白组加入等量无菌水，然后分别继续培养6 h。对照组以5 000 g离心，然后将菌体溶于5 mL的LB培养基，使用超声破碎法破碎细胞。试验组和空白组先以5 000 g离心，然后取上清，再浓缩至5 mL。分别测定3组的蛋白含量，同时进行SDS-PAGE。
2结果与分析
2.1E.coli Rosetta噬菌体的噬菌斑形态和电镜图
通过双层平板法，分离E.coli Rosetta噬菌体，命名为 ETP-1。EPT-1在双层平板上形成直径为1～3 mm的噬菌斑，噬菌斑透明（图1）。
从电镜图（图2）中可看出，ETP-1有1个正多面体对称的头部，直径约为50 nm，尾长约100 nm，尾部带有基盘。根据其形态特征，ETP-1属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
2.2E.coli Rosetta的噬菌体一步生长曲线
如E.coli Rosetta噬菌体的一步生长曲线（图3）所示，E.coli Rosetta噬菌体从吸附吸附、侵染、复制到病毒颗粒全部释放总共持续约110 min。在这个过程中，E.coli Rosetta噬菌体的潜伏期约是20 min，暴发期约70 min。
2.3温度对噬菌体活性的影响
温度对噬菌体活性的影响分析结果（图4）表明，ETP-1在25 ℃最稳定，随着温度的升高，ETP-1的存活率降低，在45 ℃和55 ℃经过1 h处理后，噬菌体的滴度降低了50%和80%，在60 ℃处理1 h后，噬菌体基本完全丧失感染能力。
2.4pH值对噬菌体活性的影响
pH值对噬菌体活性影响分析结果（图5）表明，在pH值4～8内，ETP-1依然保持着90%以上的滴度；当pH值>8后，噬菌体的滴度随着pH值的增大明显降低；当pH值=11时，ETP-1仅剩下20%的滴度；噬菌体对于酸性环境有较好的耐受能力，当pH值=3时，ETP-1仍保持着60%以上的滴度。
2.5ETP-1感染对E.coli Rosetta生长的影响
通过上述试验可知，在3.5 h加入噬菌体ETP-1后（如图6箭头所示），试验组中的E.coli Rosetta的生长受到抑制，其吸光度下降，对照组中的E.coli Rosetta的生长正常。
2.6ETP-1裂解E.coli Rosetta的效果评价
2.6.1蛋白质含量测定通过测定3管液体的蛋白质含量可知，对照组（超声破碎）蛋白质含量为2.30 mg/mL，试验组（噬菌体破碎）蛋白质含量为1.69 mg/mL，空白组蛋白质含量为0.16 mg/mL。如果通过超声破碎的细胞破碎率为100%，以蛋白质含量来衡量破碎率，则通过噬菌体破碎的效率达73%（表1）。
表1细胞裂解液的蛋白质含量
破碎方法蛋白质含量
（mg/mL）破碎率
（%）对照组（超声破碎）2.30100试验组（噬菌体破碎）1.6973
2.6.2蛋白质电泳结果通过蛋白质电泳（图7）可知，泳道1为对照组（超声破碎），其细胞完全破碎。泳道2为试验组（噬菌体破碎），泳道1和泳道2的条带基本一致，表明细胞基本裂解，而部分条带的丢失可能是细胞中部分细胞器没有完全裂解造成的。泳道3为空白组，E.coli Rosetta自然情况下也会有少数细胞自行裂解或向外分泌了少量蛋白质。
3讨论
噬菌体广泛存在于细菌存在的环境中，人们对噬菌体的研究取得了可喜的进展。目前对于噬菌体研究一般集中于噬菌体治疗、环境噬菌体上。如Cappaeelu等筛选出可以对抗耐药性金黄色葡萄球菌，并通过此噬菌体来控制金黄色葡萄球菌的感染，取得了良好的临床效果[6]。又如洪伟等从云南腾冲热泉中分离出栖热菌的噬菌体TSP-10，并对其性质进行了研究[7]。
对于分子克隆上，噬菌体研究常见于噬菌体展示技术，如Ellis等指出利用噬菌体展示多肽库可以筛选和确定线虫疫苗的抗原，这是疫苗抗原鉴定的一种新方法[8]。而王晓娜等通过噬菌体展示技术从抗体库中筛选出分枝杆菌Acr蛋白，并制备出了Acr蛋白的抗体[9]。但关于基因工程菌株的噬菌体报道比较少见，仅见黎庶等报道分离出1株基因工程菌株E.coli BL21的噬菌体EECP，并对其性质和防止流入发酵过程做了相关研究[10]。
烈性噬菌体可以高效裂解细菌，其感染效率很高，一般只需要重复4次感染周期，1个噬菌体便可杀死数十亿个细菌细胞。鉴于噬菌体有如此强的裂解效率，因此噬菌体可以作为潜在的替代超声破碎基因工程菌的工具。噬菌体在裂解细菌细胞时，裂解温和，不会因为物理作用导致基因工程菌表达产物的物理损坏。
在温度耐受方面，ETP-1在高于55 ℃基本失去感染活性；在pH值耐受方面，ETP-1在pH值超过11后，基本失去活性，而在pH值=3时，仍然有活性，说明ETP-1更能耐受酸性环境。黎庶分离出的BL21噬菌体对高温耐受能力好，90 ℃时仍具有活性，在pH耐受能力上，表现为耐碱不耐酸，pH值为3时其噬菌体活性基本丧失[10]，这与本试验室分离的噬菌体在酸碱耐受力上正好相反。
关于噬菌体对细胞裂解效率的文献报道较少，本研究通过收集裂解后的总蛋白液的蛋白量来定义噬菌体破碎效率，可知ETP-1是一种较高裂解效率的噬菌体，在6 h内噬菌体的裂解效率达到了73%；进一步试验结果表明，其裂解率在12 h可达到95%以上。鉴于噬菌体ETP-1的培养和裂解不需要专门的设备，如果需要去除裂解液中的噬菌体，可以将裂解液通过简单的超滤加以过滤收集，噬菌体的灭活可以通过50 ℃的加热来实现，可见利用ETP-1裂解E.coli Rosetta菌体不失为一种简单可行菌体破裂的方法。 参考文献：
[1]萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W. 分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社，2002：1217.
[2]Neve H，Kemper U，Geis A，Heller K J. Monitoring and characterization of lactococcal bacteriophage in a dairy plant[J]. Kiel Milchwirtsch Forschungsber，1994，46：167-178.
[3]张忠信. 病毒分类学[M]. 北京：高等教育出版社，2006：488-512.
[4]Jamalludeen N，Johnson R P，et al. Isolation and characterization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherichia coli[J]. Veterinary Microbiology，2007，124（1/2）：47-57.
[5]韩剑. 云南洱源热泉亚栖热菌噬菌体MMP17的分离鉴定及其基因组解析[J]. 昆明：昆明理工大学，2011.
[6]Cappaeelu R，Parlato M，Borriello G，et a1. Experimental phage therapy against staphylococcus aureus in mice[J]. AntiIIIicmb Agents Chemother，2007.51（8）：2765-2773.
[7]洪伟，韩剑，林连兵，等. 腾冲热海一株栖热菌裂解性噬菌体的分离及其特征[J]. 微生物学报，2010，50 （3）：322-327.
[8]Ellis S E，Newlands G F J，Nisbet A J，et al. Phage-display library biopanning as a novel approach to identifying nematode vaccine antigens[J]. Parasite Immunology，2012，34：285-295
[9]王晓娜，米志强，安小平，等. 从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体[J]. 中国生物工程杂志，2012，32（9）：22-27.
[10]黎庶. 一株基因工程菌噬菌体（EECP）的分离与鉴定[D]. 重庆：第三军医大学，2008.
关键词：细胞破碎方法；E.coli Rosetta；噬菌体；裂解效率
中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0061-03
收稿日期：2014-09-16
基金项目：国家自然科学基金（编号：31160035、31260034）。
作者简介：雷琎（1989—），男，云南昆明人，硕士研究生，主要从事噬菌体及其蛋白研究。E-mail：leijin1989@hotmail.com。
通信作者：林连兵，硕士，教授，主要从事高温噬菌体研究。E-mail：570782220@qq.com大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达多种异源蛋白质的首选系统[1]。迄今为止，由大肠杆菌改造而来的基因工程菌已达近百种之多，常用的就有50种左右[2]，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli JM109、E.coli JM110等。常见的大肠杆菌噬菌体也有很多种，如烈性噬菌体中的T4噬菌体、T1噬菌体，温和噬菌体中的λ噬菌体[3]。T4噬菌体常用于噬菌体展示，λ噬菌体常作为克隆表达的载体。实验室中常用E.coli Rosetta作为克隆表达菌株，E.coli Rosetta在E.coli BL21基础上，补充了大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子对应的tRNA，以提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。克隆表达的一般步骤是诱导表达后，直接使用超声破碎细胞。超声破碎是一种相对温和的细胞破碎方法，但是超声破碎时会产生一定的热量，对于一些结构不稳定的目的蛋白，其结构依然会被破坏。本研究以E.coli Rosetta为宿主菌，分离E.coli Rosetta的噬菌体，对其进行感染、裂解，对其生物学特征、裂解效果等进行研究，探索使用噬菌体替代超声破碎细胞的可行性。
1材料与方法
1.1菌种及噬菌体来源
E.coli Rosetta菌株。
1.2主要试剂和仪器
LB培养基、蛋白质电泳系统、恒温摇床、恒温培养箱。
1.3ETP-1的分离
采集生活污水10 mL经5 000 g、15 min离心去除杂质，再经0.22 μm的滤膜滤除细菌，收取滤液，吸取滤液5 mL与过夜培养的E.coli Rosetta 培养液5 mL混匀，于37 ℃、12 h振荡培养。
根据文献[4]的方法，采用双层平板法检测和筛选噬菌体。将上述培养液离心并通过0.22 μm滤膜过滤，取200 μL滤液和200 μL 处于对数期的E.coli Rosetta 菌液混合，静置15 min后，将其加入装有4 mL 0.9%琼脂的预热LB半固体培养基的离心管中，混匀后平铺至LB固体培养基上，37 ℃过夜培养，观察噬菌体的生长情况。若有噬菌斑，挑取单个形态均一噬菌斑。将噬菌斑置于4 mL无菌水的离心管中，37 ℃温浴0.5 h，取100 μL上述噬菌体悬液和宿主做双层平板。重复4～5次可得到纯噬菌体。
1.4ETP-1的电镜观察
取出单个噬菌斑于LB液体培养基中37 ℃过夜培养，用10%的PEG8000在4 ℃下过夜沉淀后，将沉淀溶于SM缓冲液中，再加入CsCl，使其ρ=1.5 g/mL。以36 000 r/min超速离心18 h，抽取噬菌体条带，通过负染后观察。
1.5噬菌体一步生长曲线绘制
按照文献[5]的方法。取一定量的新鲜噬菌体培养液 1 mL （病毒滴度≈107 PFU/mL）与处于对数生长期的E.coli Rosetta 10 mL混合，使得感染复数MOI=0.01，37 ℃温育 10 min。13 000 g离心2 min，弃上清，用30 μL的LB液体培养基洗涤3次，最后用30 μL LB液体培养基悬浮宿主细胞。取60 μL上述细胞到5 mL LB液体培养基，37 ℃ 180 r/min振荡培养100 min，同时开始计时，每隔10 min取100 μL培养液测定噬菌体的滴度。以感染时间为横坐标、滴度的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线，估算出噬菌体的潜伏期、暴发期。
1.6温度对噬菌体活性的影响
按照文献[5]的方法，将噬菌体悬液（将LB液体培养基099 mL和0.01 mL滴度为1×107 PFU/mL的噬菌体悬液混合），分别置于15、25、35、45、55、60 ℃处理1 h，每隔20 min取样，用双层平板测定滴度。试验重复3次，取平均值。
1.7pH值对噬菌体活性的影响
按照文献[5]的方法，将pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液体培养基0.99 mL和0.01 mL滴度为1×107 PFU/mL的噬菌体悬液混合，室温静置1 h，分别用双层平板测定噬菌体滴度。试验重复3次，取平均值。
1.8ETP-1感染E.coli Rosetta对其生长的影响
分别设立试验组和对照组，测定Rosetta的生长曲线，当培养至对数期时（D600 nm≈0.6）加入一定效价的噬菌体悬液体，使MOI=0.01，培养20 h，每隔30 min分别测定D600 nm的数值。以横坐标为时间、纵坐标为D值绘制一条试验组与对照组的Rosetta生长曲线。 1.9ETP-1对E.coli Rosetta裂解效果
准备3组150 mL的液体培养基在恒温摇床中振荡培养E.coli Rosetta，至对数期（D600 nm≈0.6）。分别设立试验组、对照组和空白组，向试验组中加入一定效价的噬菌体，使MOI=0.01，空白组加入等量无菌水，然后分别继续培养6 h。对照组以5 000 g离心，然后将菌体溶于5 mL的LB培养基，使用超声破碎法破碎细胞。试验组和空白组先以5 000 g离心，然后取上清，再浓缩至5 mL。分别测定3组的蛋白含量，同时进行SDS-PAGE。
2结果与分析
2.1E.coli Rosetta噬菌体的噬菌斑形态和电镜图
通过双层平板法，分离E.coli Rosetta噬菌体，命名为 ETP-1。EPT-1在双层平板上形成直径为1～3 mm的噬菌斑，噬菌斑透明（图1）。
从电镜图（图2）中可看出，ETP-1有1个正多面体对称的头部，直径约为50 nm，尾长约100 nm，尾部带有基盘。根据其形态特征，ETP-1属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
2.2E.coli Rosetta的噬菌体一步生长曲线
如E.coli Rosetta噬菌体的一步生长曲线（图3）所示，E.coli Rosetta噬菌体从吸附吸附、侵染、复制到病毒颗粒全部释放总共持续约110 min。在这个过程中，E.coli Rosetta噬菌体的潜伏期约是20 min，暴发期约70 min。
2.3温度对噬菌体活性的影响
温度对噬菌体活性的影响分析结果（图4）表明，ETP-1在25 ℃最稳定，随着温度的升高，ETP-1的存活率降低，在45 ℃和55 ℃经过1 h处理后，噬菌体的滴度降低了50%和80%，在60 ℃处理1 h后，噬菌体基本完全丧失感染能力。
2.4pH值对噬菌体活性的影响
pH值对噬菌体活性影响分析结果（图5）表明，在pH值4～8内，ETP-1依然保持着90%以上的滴度；当pH值>8后，噬菌体的滴度随着pH值的增大明显降低；当pH值=11时，ETP-1仅剩下20%的滴度；噬菌体对于酸性环境有较好的耐受能力，当pH值=3时，ETP-1仍保持着60%以上的滴度。
2.5ETP-1感染对E.coli Rosetta生长的影响
通过上述试验可知，在3.5 h加入噬菌体ETP-1后（如图6箭头所示），试验组中的E.coli Rosetta的生长受到抑制，其吸光度下降，对照组中的E.coli Rosetta的生长正常。
2.6ETP-1裂解E.coli Rosetta的效果评价
2.6.1蛋白质含量测定通过测定3管液体的蛋白质含量可知，对照组（超声破碎）蛋白质含量为2.30 mg/mL，试验组（噬菌体破碎）蛋白质含量为1.69 mg/mL，空白组蛋白质含量为0.16 mg/mL。如果通过超声破碎的细胞破碎率为100%，以蛋白质含量来衡量破碎率，则通过噬菌体破碎的效率达73%（表1）。
表1细胞裂解液的蛋白质含量
破碎方法蛋白质含量
（mg/mL）破碎率
（%）对照组（超声破碎）2.30100试验组（噬菌体破碎）1.6973
2.6.2蛋白质电泳结果通过蛋白质电泳（图7）可知，泳道1为对照组（超声破碎），其细胞完全破碎。泳道2为试验组（噬菌体破碎），泳道1和泳道2的条带基本一致，表明细胞基本裂解，而部分条带的丢失可能是细胞中部分细胞器没有完全裂解造成的。泳道3为空白组，E.coli Rosetta自然情况下也会有少数细胞自行裂解或向外分泌了少量蛋白质。
3讨论
噬菌体广泛存在于细菌存在的环境中，人们对噬菌体的研究取得了可喜的进展。目前对于噬菌体研究一般集中于噬菌体治疗、环境噬菌体上。如Cappaeelu等筛选出可以对抗耐药性金黄色葡萄球菌，并通过此噬菌体来控制金黄色葡萄球菌的感染，取得了良好的临床效果[6]。又如洪伟等从云南腾冲热泉中分离出栖热菌的噬菌体TSP-10，并对其性质进行了研究[7]。
对于分子克隆上，噬菌体研究常见于噬菌体展示技术，如Ellis等指出利用噬菌体展示多肽库可以筛选和确定线虫疫苗的抗原，这是疫苗抗原鉴定的一种新方法[8]。而王晓娜等通过噬菌体展示技术从抗体库中筛选出分枝杆菌Acr蛋白，并制备出了Acr蛋白的抗体[9]。但关于基因工程菌株的噬菌体报道比较少见，仅见黎庶等报道分离出1株基因工程菌株E.coli BL21的噬菌体EECP，并对其性质和防止流入发酵过程做了相关研究[10]。
烈性噬菌体可以高效裂解细菌，其感染效率很高，一般只需要重复4次感染周期，1个噬菌体便可杀死数十亿个细菌细胞。鉴于噬菌体有如此强的裂解效率，因此噬菌体可以作为潜在的替代超声破碎基因工程菌的工具。噬菌体在裂解细菌细胞时，裂解温和，不会因为物理作用导致基因工程菌表达产物的物理损坏。
在温度耐受方面，ETP-1在高于55 ℃基本失去感染活性；在pH值耐受方面，ETP-1在pH值超过11后，基本失去活性，而在pH值=3时，仍然有活性，说明ETP-1更能耐受酸性环境。黎庶分离出的BL21噬菌体对高温耐受能力好，90 ℃时仍具有活性，在pH耐受能力上，表现为耐碱不耐酸，pH值为3时其噬菌体活性基本丧失[10]，这与本试验室分离的噬菌体在酸碱耐受力上正好相反。
关于噬菌体对细胞裂解效率的文献报道较少，本研究通过收集裂解后的总蛋白液的蛋白量来定义噬菌体破碎效率，可知ETP-1是一种较高裂解效率的噬菌体，在6 h内噬菌体的裂解效率达到了73%；进一步试验结果表明，其裂解率在12 h可达到95%以上。鉴于噬菌体ETP-1的培养和裂解不需要专门的设备，如果需要去除裂解液中的噬菌体，可以将裂解液通过简单的超滤加以过滤收集，噬菌体的灭活可以通过50 ℃的加热来实现，可见利用ETP-1裂解E.coli Rosetta菌体不失为一种简单可行菌体破裂的方法。 参考文献：
[1]萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W. 分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社，2002：1217.
[2]Neve H，Kemper U，Geis A，Heller K J. Monitoring and characterization of lactococcal bacteriophage in a dairy plant[J]. Kiel Milchwirtsch Forschungsber，1994，46：167-178.
[3]张忠信. 病毒分类学[M]. 北京：高等教育出版社，2006：488-512.
[4]Jamalludeen N，Johnson R P，et al. Isolation and characterization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherichia coli[J]. Veterinary Microbiology，2007，124（1/2）：47-57.
[5]韩剑. 云南洱源热泉亚栖热菌噬菌体MMP17的分离鉴定及其基因组解析[J]. 昆明：昆明理工大学，2011.
[6]Cappaeelu R，Parlato M，Borriello G，et a1. Experimental phage therapy against staphylococcus aureus in mice[J]. AntiIIIicmb Agents Chemother，2007.51（8）：2765-2773.
[7]洪伟，韩剑，林连兵，等. 腾冲热海一株栖热菌裂解性噬菌体的分离及其特征[J]. 微生物学报，2010，50 （3）：322-327.
[8]Ellis S E，Newlands G F J，Nisbet A J，et al. Phage-display library biopanning as a novel approach to identifying nematode vaccine antigens[J]. Parasite Immunology，2012，34：285-295
[9]王晓娜，米志强，安小平，等. 从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体[J]. 中国生物工程杂志，2012，32（9）：22-27.
[10]黎庶. 一株基因工程菌噬菌体（EECP）的分离与鉴定[D]. 重庆：第三军医大学，2008.