【摘 要】
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目的 探索小鼠精原干细胞(SSCs)冷冻保存方法 以及解冻后体外快速增殖的条件. 方法 实验以6d龄雄性昆明小白鼠为材料,两步酶消化法分离小鼠睾丸生殖细胞,Percoll非连续密度梯
【机 构】
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南京农业大学动物胚胎工程技术中心,新疆农垦科学院畜牧兽医研究所
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目的 探索小鼠精原干细胞(SSCs)冷冻保存方法 以及解冻后体外快速增殖的条件. 方法 实验以6d龄雄性昆明小白鼠为材料,两步酶消化法分离小鼠睾丸生殖细胞,Percoll非连续密度梯度离心法富集小鼠精原干细胞,随后加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞.以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100μg/L的胶质细胞源性神经营养因子, WST-8比色法分析培养SSCs 复苏后的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和RT-PCR技术,对培养的SSCs进行鉴定. 结果 冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率最高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存SSCs,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法 简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后SSCs贴壁时间为8～12h,24h可见细胞分裂,48h细胞出现迅速增殖,96h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时精原干细胞增殖近5倍. 结论 本实验所用培养条件,可以使经长期冷冻的SSCs短期快速增殖.
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