【摘 要】
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运用反转录PCR与5'-及3'-末端快速扩增技术,从缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)H4301中克隆到胞苷二磷酸(CDP)-乙醇胺:二酰基甘油乙醇胺磷酸转移酶(EPT)的基因MiEPT.其cD
【机 构】
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上海海洋大学,水产种质资源开发利用教育部重点实验室,上海201306;上海海洋大学,国家海洋生物科学国际联合研究中心,上海201306
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运用反转录PCR与5'-及3'-末端快速扩增技术,从缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)H4301中克隆到胞苷二磷酸(CDP)-乙醇胺:二酰基甘油乙醇胺磷酸转移酶(EPT)的基因MiEPT.其cDNA序列全长1914bp,其中,5'-非翻译区(UTR)长217 bp,3'-UTR长533 bp,开放阅读框(ORF)长1164 bp,编码由387个氨基酸组成的蛋白.以缺刻缘绿藻基因组DNA为模板扩增到该基因的DNA序列,长为2853 bp.这两条序列的比对结果显示,MiEPT含有6个内含子,它们将其ORF分隔成7个外显子.经预测,MiEPT为含有8个跨膜区的膜整合蛋白.多序列比结果显示,MiEPT具有CDP-醇磷脂酰转移酶基序.基于不同物种EPT的氨基酸序列所构建的邻接聚类结果表明,MiEPT与已知功能的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)EPT聚类在一起,由此推测,MiEPT可以催化磷脂酰乙醇胺(PE)的生物合成.为鉴定MiEPT的基因功能,利用表达载体pET-23a实现了在大肠杆菌中重组表达MiEPT的目的.使用超离心技术,获得部分纯化含重组MiEPT的组分.体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiEPT具有EPT和胆碱磷酸转移酶(CPT)的活性.经棒状薄层色谱的定量分析,可知MiEPT的EPT酶活性是CPT的10.3倍,从而表明,MiEPT在缺刻缘绿藻中能同时参与PE和磷脂酰胆碱的生物合成,但更倾向利用CDP-乙醇胺生产PE.
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