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[摘要]目的研究基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及其组织抑制剂TIMP-1与肺癌浸润转移及CT征象的关系。方法用ELISA法检测血清中MMP-9和TIMP-1的含量，所有病例行胸部CT。结果MMP-9和TIMP-1在小细胞肺癌患者和非小细胞肺癌患者血清中的含量均显著高于正常对照组（P<0.05）。MMP-9和TIMP-1在瘤体>3cm、有纵隔淋巴结转移和存在分叶征者血清中的含量均显著高于瘤体<3cm、无纵隔淋巴结转移和无分叶征者（P<0.05）。结论MMP-9、TIMP-1与肺癌浸润转移关系密切，检测血清中MMP-9和TIMP-1的含量有助于判断肿瘤的恶性度和转移的能力。
关键词：肺癌基质金属蛋白酶CT
The effect ofmatrix metalloproteinase 9 （MMP-9） and its tissue inhibitor （TIMP-1） on invasion or metastasis of lung cancer and the association between them and signs of chest CT
[Abstract] Objective： To study the effect of matrix metalloproteinase 9 and its tissue inhibitor （TIMP-1） on invasion or metastasis of lung cancer and study the association between them and signs with chest CT. Method： Fifty-six specimens were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， and chest CT.Results： MMP-9 and TIMP-1 level in lung cancer patients was higher than that in healthy people（P<0.05）.And the MMP-9 and TIMP-1 level in lung cancer patients with mass diamitor>3cm was higher than that with diamitor≤3cm， also the same relationship between patients with mass lobe and without mass lobe or with diaphram lymphoid node metastasis and without diaphram lymphoid node metastasis（P<0.05）. Conclusion： There is a strong association between MMP-9、TIMP-1 and cancer dissemination. It’s helpful for differentiating m alignant or benign tumor and its metastasis capacity to determine the content of MMP-9 and TIMP-1 in blood serum.
[key words] lung cancer； matrix metalloproteinase； CT
中图分类号：R734.2 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0057-03
浸润和转移是肿瘤致死的主要原因之一，浸润是肿瘤转移的首要环节。肿瘤细胞必须具有降解细胞外基质的能力，才能向周围浸润，并向血管、淋巴管及远处转移。基质金属蛋白酶（MMP）是一系列在生理情况下可降解细胞外基质及基底膜的内肽酶总称，其中明胶酶（MMP-9）可降解基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，与肿瘤浸润转移关系密切[12]。组织金属蛋白抑制剂-1（TIMP-1）为特异性抑制因子，能与MMP-9形成非共价的1：1复合物抑制MMP-9的活性，进而抑制肿瘤的浸润和转移[3]。本研究通过ELASA的方法检测56例肺癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的水平，与正常人对照组进行比较，并探讨癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的水平与瘤体大小、纵隔淋巴结转移和CT瘤体分叶征之间的关系。
1材料与方法
1.1材料
56例肺癌患者血清标本取自河南大学附属淮河医院胸外科。男性44例，女性12例，年龄38～71岁，中位年龄62岁。其中小细胞肺癌患者21例，非小细胞肺癌患者35例。正常对照为32例健康成人。每例抽取静脉血3ml，血液静置2~5h后，离心2500bp/min 10min，离心后血清位于上层，小心吸取血清于冻存管内，-20ºC保存。
ELISA试剂盒由上海森华实业有限公司生产。酶联免疫检测仪型号为DG302A型。CT机型号为SIEMENS BALANCE 螺旋CT机。
1.2方法
1.2.1ELISA法按照ELASA试剂盒说明书对血清中MMP-9和TIMP-1进行检测。（1）建立标准曲线，在96孔酶标板上，设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品（1000ng/ml）100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后从第七孔吸出100μl弃去，使之体积均为100μl。第8孔为空白对照。（2）待测品孔每孔加入待测样品100μl。（3）将反应板充分混匀后置37ºC120 min。（4）用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（5）每孔中加入第一抗体工作液50μl。（6）将反应板置于37ºC60 min。（7） 用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（8）每孔加酶标抗体工作液100μl。（9）将反应板置37ºC60 min。（10）用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（11）每孔加入底物工作液100μl，置37ºC暗处反应10 min。（12）每孔加入1滴终止液混匀。（12）以空白孔为标准调零，在酶标仪490nm测OD值。（13）以标准品之OD值作出标准曲线。（14）根据样品OD值在该曲线图上查出相应含量。
1.2.2CT技术采用Prospeed Plus心型CT机，pitch=1，层厚层距各为10MM。纵隔淋巴结转移以淋巴结长径>15MM、短径>10MM为判定标准。
1.2.3统计采用SPSS10.0软件对数据进行分析，以P<0.05为显著性差异水准。
2结果
MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者血清中的含量为735.69±66.57和972.47±73.84，在小细胞肺癌患者血清中的含量为794.18±92.54和1214.33±116.61，在正常对照组中为186.38±87.52和465.57±80.56。MMP-9和TIMP-1在小细胞肺癌患者和非小细胞肺癌患者血清中的含量均显著高于正常对照组（P<0.05）
瘤体>3cm 的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为805.27±97.62和1275.48±105.27，在瘤体≤3cm的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别724.16±74.53和911.53±84.16，前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）；瘤体有分叶的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为793.33±85.66和1186.26±94.35，瘤体无分叶者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为736.87±72.51和1000.44±101.92，前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）；有纵隔淋巴结转移的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为821.66±106.37和1358.38±116.74，无纵隔淋巴结转移的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为708.48±64.42和828.15±79.21。前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）。（图1-2）
1.肺癌无纵隔淋巴结转移2.肺癌纵隔淋巴结转移
3讨论
浸润和转移是恶性肿瘤主要的生物学特征，也是影响肿瘤治疗和预后的主要因素。肿瘤扩散首先必须降解ECM和BM屏障。基质金属蛋白酶家族中的Ⅳ型胶原酶可以降解Ⅳ型、Ⅴ型胶原、层粘连蛋白等成分破坏成分破坏BM的完整性。Ⅳ型胶原酶有MMP-2和MMP-9两个亚型，其中MMP-9是MMPs中分子最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶。一方面降解破坏靠近肿瘤表面的ECM和BM，使肿瘤细胞可沿着缺失的BM向周围组织浸润，另一方面则通毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤侵袭和转移。TIMP-1可与活化的间质胶原酶，活化的间质溶解素和MMP-9以1：1非共价结合形成复合物，抑制MMP-9的活性，从而抑制肿瘤的浸润和转移。
本次试验用ELASA的方法检测肺癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量，并观察其含量与相应CT征象之间的关系。结果显示：MMP-9和TIMP-1在肺癌患者（无论是小细胞肺癌患者还是非小细胞肺癌患者）血清中的含量均显著高于正常对照组（P<0.05）。这说明MMP-9和TIMP-1与肺癌的发生发展过程密切相关。
肿瘤的大小、部位和浸润转移的情况均可在胸部CT中观察到相应的表现。一般而言，当肿瘤体积达到3CM以上时，即可形成轮廓清楚密实肿块影，可呈圆形、椭圆形或不规则形，可有明显分叶征及毛刺征。瘤体直径>3CM的肿瘤恶性程度大，其增殖、浸润和转移能力明显增强。本次实验发现：瘤体直径>3cm者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于瘤体直径≤3cm者（P<0.05）；有纵隔淋巴结转移者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于无纵隔淋巴结转移者（P<0.05）。这一结果说明：MMP-9和TIMP-1和肿瘤转移关系密切。MMP-9具有促进肿瘤浸润转移的作用，由于TIMP-1与MMP-9相结合抑制MMP-9的生物活性，因此TIMP-1的含量也随着MMP-9的增高而增高。
肿瘤分叶的形成，部分认为是肿瘤在发育过程中，所处空间位置上瘤体各部分受的阻力不一、生长速度不均形成[4]。在本次实验中：瘤体有分叶者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于瘤体无分叶者（P<0.05）。
上述实验结果均显示：血清中高水平的MMP-9和TIMP-1预示着肿瘤有较强的浸润转移的能力，恶性度较高。因此，检测血清中MMP-9和TIMP-1的含量对了解肿瘤的恶性度和转移的能力很有帮助。此外利用分子生物学技术或某些化学制剂使MMP-9活性降低或使TIMP-1活性增强，均可在一定程度上抑制肺癌的浸润和转移。对于MMP-9和TIMP-1的深入研究有望进一步揭示肿瘤转移的具体机制从而提高临床肿瘤的治疗水平。
参考文献
[1] Sienel W， Hellers J， Alicia MH， et al. Prognostic impact of matrix metalloproteinase 9 in operable non-small cell lumg cancer. Int J Cancer 2002；103：647-651.
[2] Li L， Zhang S， Lin H， et al. Relationship of Expression Unbalance of Matrix Metalloproteinase and Tissue inhibitor of Metalloproteinase to Invasiveness and Metastasis in Gastric Carcinomas. Chinese Journal of Cancer， 2002；21（3）：305-310.
[3] 韩溟、许丽艳. 恶性肿瘤中MMP-9表达调控机制研究进展[J]. 国外医学分子生物学分册2003；25（1）：24-26.
[4] 周康荣. 胸部颈面部CT[M] .复旦大学出版社1996. 32-38.
关键词：肺癌基质金属蛋白酶CT
The effect ofmatrix metalloproteinase 9 （MMP-9） and its tissue inhibitor （TIMP-1） on invasion or metastasis of lung cancer and the association between them and signs of chest CT
[Abstract] Objective： To study the effect of matrix metalloproteinase 9 and its tissue inhibitor （TIMP-1） on invasion or metastasis of lung cancer and study the association between them and signs with chest CT. Method： Fifty-six specimens were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， and chest CT.Results： MMP-9 and TIMP-1 level in lung cancer patients was higher than that in healthy people（P<0.05）.And the MMP-9 and TIMP-1 level in lung cancer patients with mass diamitor>3cm was higher than that with diamitor≤3cm， also the same relationship between patients with mass lobe and without mass lobe or with diaphram lymphoid node metastasis and without diaphram lymphoid node metastasis（P<0.05）. Conclusion： There is a strong association between MMP-9、TIMP-1 and cancer dissemination. It’s helpful for differentiating m alignant or benign tumor and its metastasis capacity to determine the content of MMP-9 and TIMP-1 in blood serum.
[key words] lung cancer； matrix metalloproteinase； CT
中图分类号：R734.2 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0057-03
浸润和转移是肿瘤致死的主要原因之一，浸润是肿瘤转移的首要环节。肿瘤细胞必须具有降解细胞外基质的能力，才能向周围浸润，并向血管、淋巴管及远处转移。基质金属蛋白酶（MMP）是一系列在生理情况下可降解细胞外基质及基底膜的内肽酶总称，其中明胶酶（MMP-9）可降解基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，与肿瘤浸润转移关系密切[12]。组织金属蛋白抑制剂-1（TIMP-1）为特异性抑制因子，能与MMP-9形成非共价的1：1复合物抑制MMP-9的活性，进而抑制肿瘤的浸润和转移[3]。本研究通过ELASA的方法检测56例肺癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的水平，与正常人对照组进行比较，并探讨癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的水平与瘤体大小、纵隔淋巴结转移和CT瘤体分叶征之间的关系。
1材料与方法
1.1材料
56例肺癌患者血清标本取自河南大学附属淮河医院胸外科。男性44例，女性12例，年龄38～71岁，中位年龄62岁。其中小细胞肺癌患者21例，非小细胞肺癌患者35例。正常对照为32例健康成人。每例抽取静脉血3ml，血液静置2~5h后，离心2500bp/min 10min，离心后血清位于上层，小心吸取血清于冻存管内，-20ºC保存。
ELISA试剂盒由上海森华实业有限公司生产。酶联免疫检测仪型号为DG302A型。CT机型号为SIEMENS BALANCE 螺旋CT机。
1.2方法
1.2.1ELISA法按照ELASA试剂盒说明书对血清中MMP-9和TIMP-1进行检测。（1）建立标准曲线，在96孔酶标板上，设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品（1000ng/ml）100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后从第七孔吸出100μl弃去，使之体积均为100μl。第8孔为空白对照。（2）待测品孔每孔加入待测样品100μl。（3）将反应板充分混匀后置37ºC120 min。（4）用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（5）每孔中加入第一抗体工作液50μl。（6）将反应板置于37ºC60 min。（7） 用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（8）每孔加酶标抗体工作液100μl。（9）将反应板置37ºC60 min。（10）用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。（11）每孔加入底物工作液100μl，置37ºC暗处反应10 min。（12）每孔加入1滴终止液混匀。（12）以空白孔为标准调零，在酶标仪490nm测OD值。（13）以标准品之OD值作出标准曲线。（14）根据样品OD值在该曲线图上查出相应含量。
1.2.2CT技术采用Prospeed Plus心型CT机，pitch=1，层厚层距各为10MM。纵隔淋巴结转移以淋巴结长径>15MM、短径>10MM为判定标准。
1.2.3统计采用SPSS10.0软件对数据进行分析，以P<0.05为显著性差异水准。
2结果
MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者血清中的含量为735.69±66.57和972.47±73.84，在小细胞肺癌患者血清中的含量为794.18±92.54和1214.33±116.61，在正常对照组中为186.38±87.52和465.57±80.56。MMP-9和TIMP-1在小细胞肺癌患者和非小细胞肺癌患者血清中的含量均显著高于正常对照组（P<0.05）
瘤体>3cm 的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为805.27±97.62和1275.48±105.27，在瘤体≤3cm的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别724.16±74.53和911.53±84.16，前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）；瘤体有分叶的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为793.33±85.66和1186.26±94.35，瘤体无分叶者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为736.87±72.51和1000.44±101.92，前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）；有纵隔淋巴结转移的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为821.66±106.37和1358.38±116.74，无纵隔淋巴结转移的肿瘤患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量分别为708.48±64.42和828.15±79.21。前者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于后者（P<0.05）。（图1-2）
1.肺癌无纵隔淋巴结转移2.肺癌纵隔淋巴结转移
3讨论
浸润和转移是恶性肿瘤主要的生物学特征，也是影响肿瘤治疗和预后的主要因素。肿瘤扩散首先必须降解ECM和BM屏障。基质金属蛋白酶家族中的Ⅳ型胶原酶可以降解Ⅳ型、Ⅴ型胶原、层粘连蛋白等成分破坏成分破坏BM的完整性。Ⅳ型胶原酶有MMP-2和MMP-9两个亚型，其中MMP-9是MMPs中分子最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶。一方面降解破坏靠近肿瘤表面的ECM和BM，使肿瘤细胞可沿着缺失的BM向周围组织浸润，另一方面则通毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤侵袭和转移。TIMP-1可与活化的间质胶原酶，活化的间质溶解素和MMP-9以1：1非共价结合形成复合物，抑制MMP-9的活性，从而抑制肿瘤的浸润和转移。
本次试验用ELASA的方法检测肺癌患者血清中MMP-9和TIMP-1的含量，并观察其含量与相应CT征象之间的关系。结果显示：MMP-9和TIMP-1在肺癌患者（无论是小细胞肺癌患者还是非小细胞肺癌患者）血清中的含量均显著高于正常对照组（P<0.05）。这说明MMP-9和TIMP-1与肺癌的发生发展过程密切相关。
肿瘤的大小、部位和浸润转移的情况均可在胸部CT中观察到相应的表现。一般而言，当肿瘤体积达到3CM以上时，即可形成轮廓清楚密实肿块影，可呈圆形、椭圆形或不规则形，可有明显分叶征及毛刺征。瘤体直径>3CM的肿瘤恶性程度大，其增殖、浸润和转移能力明显增强。本次实验发现：瘤体直径>3cm者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于瘤体直径≤3cm者（P<0.05）；有纵隔淋巴结转移者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于无纵隔淋巴结转移者（P<0.05）。这一结果说明：MMP-9和TIMP-1和肿瘤转移关系密切。MMP-9具有促进肿瘤浸润转移的作用，由于TIMP-1与MMP-9相结合抑制MMP-9的生物活性，因此TIMP-1的含量也随着MMP-9的增高而增高。
肿瘤分叶的形成，部分认为是肿瘤在发育过程中，所处空间位置上瘤体各部分受的阻力不一、生长速度不均形成[4]。在本次实验中：瘤体有分叶者血清中MMP-9和TIMP-1的含量显著高于瘤体无分叶者（P<0.05）。
上述实验结果均显示：血清中高水平的MMP-9和TIMP-1预示着肿瘤有较强的浸润转移的能力，恶性度较高。因此，检测血清中MMP-9和TIMP-1的含量对了解肿瘤的恶性度和转移的能力很有帮助。此外利用分子生物学技术或某些化学制剂使MMP-9活性降低或使TIMP-1活性增强，均可在一定程度上抑制肺癌的浸润和转移。对于MMP-9和TIMP-1的深入研究有望进一步揭示肿瘤转移的具体机制从而提高临床肿瘤的治疗水平。
参考文献
[1] Sienel W， Hellers J， Alicia MH， et al. Prognostic impact of matrix metalloproteinase 9 in operable non-small cell lumg cancer. Int J Cancer 2002；103：647-651.
[2] Li L， Zhang S， Lin H， et al. Relationship of Expression Unbalance of Matrix Metalloproteinase and Tissue inhibitor of Metalloproteinase to Invasiveness and Metastasis in Gastric Carcinomas. Chinese Journal of Cancer， 2002；21（3）：305-310.
[3] 韩溟、许丽艳. 恶性肿瘤中MMP-9表达调控机制研究进展[J]. 国外医学分子生物学分册2003；25（1）：24-26.
[4] 周康荣. 胸部颈面部CT[M] .复旦大学出版社1996. 32-38.