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摘要 [目的]建立一种测定水产品地西泮农药残留的分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法。[方法]样品先后经1%氨水-乙腈和1%乙酸-乙腈进行提取，PSA∶C18∶无水MgSO4=1∶0.5∶3为吸附剂进行分散固相萃取净化，C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离，0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵∶甲醇（90∶10）为初始流动相，结合超高效液相色谱—串联质谱（UPLC-MS/MS）进行定量分析。[结果]添加样品的回收率为92.5%～95.4%，相对标准偏差（RSD）为5.2%～7.3%，检出限为1.0 μg/kg。[结论]该方法灵敏度、精密度、回收率均能满足水产品中地西泮的快速分析测定。
关键词 水产品;分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱;地西泮;农药残留
中图分类号 TS-254.7 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）12-0198-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.052
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Determination of Diazepam in Aquatic Products by Dispersive Solid Phase Extraction Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
ZENG Jun jie1，2，CHEN Si1，ZHANG Xiao jun1 et al （1.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang，Zhoushan，Zhejiang 316021;2.Marine and Fishery Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316021）
Abstract [Objective]A method for the determination of diazepam pesticide residues in aquatic products by dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established.[Method]The samples were successively extracted by 1% ammonia water acetonitrile and 1% acetic acid acetonitrile，and purified by dispersive solid phase extraction with PSA∶C18∶anhydrous MgSO4=1∶0.5∶3 as adsorbent，C18 column （2.1 mm×100 mm，1.7 μ m） separation，0.1% formic acid 5 mmol/L ammonium acetate：methanol （90∶10） as the initial mobile phase，combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC MS/MS） for quantitative analysis.[Result]The recoveries of the added samples were 92.5%-95.4%，and the relative standard deviations （RSD） were 5.2%-7.3%.The detection limit was 1.0 μg/kg.[Conclusion]The sensitivity，precision and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of diazepam in aquatic products.
Key words Aquatic products;Dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Diazepam;Pesticide residues
地西泮，又名安定，是苯二氮卓類药物（ BDZ） ，为第二代催眠药[1]。在临床上主要用于治疗失眠[2]，但患者长期服用[3]，会出现依赖性和耐药性，停药后又易出现易怒、情绪激动、幻听等症状[4]，导致失眠加重[5-7]。在家禽家畜养殖业中使用这类药物的现象时有发生，通常养殖者用药来促进家禽家畜生长，达到增肥的目的[8]，但在水产养殖业中较少投入使用。近年来，不少水产养殖者和商贩为了达到提高水产品成活率目的[9-12]，在养殖和运输环节中频繁使用地西泮来放缓鱼类的新陈代谢，减轻鱼体的环境压力。我国农业部235号公告已明确规定在动物性食品中不得检出地西泮;农业部176号公告也规定严禁在饲料和动物饮用水中使用地西泮等精神类药物。据相关报道，近年来全国已有多个省份水产品中地西泮残留检出的事件发生[13]。2020年，笔者在一次鱼类药物残留大排查中发现，多例水产品含有地西泮，并且检出水平较高，这必将给居民的水产品消费安全带来巨大的隐患。
目前地西泮的检测方法较多，主要有气相色谱-串联质谱法（GC-MS）[14-17]、高效液相色谱法（HPLC）[18-19]和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[20-22]等，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）拥有超高效液相快速、有效的分离能力和串联质谱的精准灵敏度，是一种快速发展的分析技术[23]。将超高效液相色谱-串联质谱法与分散固相萃取技术相结合[24]是目前比较流行的检测方式，兼具两者的优点，可以真正实现多种兽药残留的快速检测。该研究使用分散固相萃取技术进行前处理，超高效液相色谱-串联质谱法为检测方法，实现了地西泮残留的快速检测，为分散固相萃取前处理方式在水产品领域的应用提供更强的保障。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
地西泮（DXP）、氘代地西泮（DXP-D5），纯度均>98%， 美国Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸铵，色谱纯，德国Merck公司;MgSO4（分析纯）、氨水（分析纯）、PSA（粒径40～60 μm）、C18（粒径50 μm），上海国药集团。
1.2 仪器与设备
ACQUITYTM 超高效液相色谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），美国Waters公司; 3-30K 高速冷冻离心机，Sigma公司;MX-S 涡旋搅拌器，美国Scilogex公司;N-EVAP-112氮吹仪，美国Organomation公司。
1.3 溶液的制备
1.3.1 吸附剂的制备。取PSA、C18、MgSO4适量，按照1∶0.5∶3的比例混匀，放入烘箱烘干，备用。
1.3.2 標准曲线溶液的制备。分别准确称取1 mg地西泮和氘代地西泮固体标准物质，用甲醇溶解定容至100 mL，配成10 μg/mL的中间使用液，于-18 ℃下避光保存。中间使用液再次稀释，配制成100 ng/mL使用液，4 ℃避光备用。
1.4 UPLC-MS条件
1.4.1 色谱条件。ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱温40 ℃;样品室温度10 ℃;进样量1.0 μL;流动相为0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液（A）、甲醇（B）;流速0.3 mL/min;洗脱条件：0～0.5 min，10% B;0.5～2.5 min，30% B;2.5～5.0 min，95% B;5.0～7.5 min，95% B;7.5～1.0 min，10% B。
1.4.2 质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）;扫描方式为多反应监测（MRM）;毛细管电压3.2 kV;锥孔电压38 V;脱溶剂气温度380 ℃;离子源温度120 ℃;碰撞池压力0.003 hPa;锥孔气流量 50 L/h;干燥气体流速600 L/h。地西泮及其氘代物的质谱参数如表1所示。
1.5 样品前处理
1.5.1 提取。
称取样品1 g于15 mL离心管中，准确加入50 μL混合内标使用液，涡旋30 s。加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液、2.5 g 氯化钠，涡旋提取1 min，超声提取10 min，以6 000 r/min 离心5 min。收集上清液。剩余混合物中再加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液，重复提取1次，合并2次上清液，待净化。
1.5.2 净化。将吸附剂加入“1.5.1”提取液中，旋紧螺旋盖，高速涡旋1 min，6 000 r/min离心5 min。
1.5.3 浓缩、转溶。
合并所有有机相溶液，于40 ℃下氮气吹至干。准确加入1.0 mL 10%甲醇溶液溶解残渣，涡旋混合1 min，经0.22 μm滤膜过滤后上机检测。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
以20 μL/min的流速将标准溶液打入离子源，在正离子模式下进行扫描，对毛细管电压和锥孔电压进行优化，确定地西泮的毛细管电压、锥孔电压分别为3.2 kV和38 V。用二级质谱将母离子击碎，选取经碰撞后响应值较高的2个子离子分别为定量离子和定性离子，并进行优化，如图1所示。
2.2 色谱条件的优化
该试验以C18色谱柱作为色谱分析柱，分别选择乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈体系以及0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇体系作为流动相，发现乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但甲醇作为有机相时峰形比乙腈好，响应值高，同时在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol乙酸铵，改善了被待测物质的峰形，这是由于有机酸和挥发性盐提高了他们的分离度和离子化效率，图2～3为待测物质的色谱图。
2.3 前处理优化
2.3.1 提取条件的优化。
地西泮极性偏弱，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶剂，不溶于水。该试验选取1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈、乙酸乙酯和甲醇4种提取溶剂进行比较，4种溶剂提取效率如图4所示。
试验表明甲醇提取，地西泮回收率较好（93.9%），但部分油脂被萃取到提取液中，对仪器（UPLC-MS/MS）响应值有明显的抑制作用。1%氨水乙腈提取地西泮回收率91.7%，故选择乙腈超声10 min，提取2次保证提取率的最大化。
2.3.2 净化条件的选择。
目前，在对地西泮报道的已有文献中，多以HLB、C18等SPE净化柱为主，该试验以分散固相萃取为前处理方式，对MgSO4、HLB、PSA、C18以及吸附剂进行对比，净化效果见图5。结果表明弱阳离子（HLB、C18）等SPE柱净化回收率一般，回收率无法满足水产品检测的需求;MgSO4、PSA能够去除样品中的脂肪酸、糖类物质等不同杂质，平均回收率高于SPE的方法，并且净化效果明显，但回收率过低，也无法满足水产品的检测需求;混合吸附剂在除去大部分杂质的同时，回收率达到93.2%，符合水产品检测回收率70%～120%的要求，故选用混合吸附剂。
2.3.3 吸附剂使用量的优化。
分别将0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g 的PSA用于净化试验，比较PSA不同使用量的净化效果，结果如图6所示。试验表明，当PSA用量为0.2～0.8 g时，目标物质回收率在92%～95%，回收率均比较理想，但是考虑到伴随着使用量增加，杂质去除效率更好，因此选用使用量最大的。当使用量在逐渐增加，回收率明显降低，此时吸附剂足够吸附杂质，分析原因可能是吸附剂中PSA成分中氨基游离出来，与目标物质中某些基团发生化学反应。综上所述，选择PSA的使用量为0.8 g，既保证了净化后样品的纯净，又保证试验回收率满足试验方法。 2.4 方法学验证
2.4.1 检出限、定量限及线性关系。
取草鱼空白样品，按照“1.5”的前处理方法，得到空白基质溶液，配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的空白基质混合标准工作曲线，以待测物质的峰面积（y）和相应的浓度（x）绘制标准曲线，得出线性回归方程为y=0.659 359x-0.042 260 9（r=0.997），表明地西泮浓度在0.5～50.0 μg/L与峰面积的线性关系良好。根据7个空白样品的基线噪音求其平均值，按3倍信噪比计算其方法检测限（LOD），10倍信噪比计算其方法定量限（LOQ），该化合物检出限和定量限分别为0.5和1.0 μg/kg。
2.4.2 回收率和精密度。
通过加标回收试验来评价方法的准确性、精密度和回收率，标准曲线见图7。在前处理前，将混合标准溶液加至1 g草鱼基质中，然后按照“1.5”方法进行前处理。其中，混合标准工作液分为1.0、2.0、5.0 ng/mL这3个水平，每个平行测定3次。从表2可以看出，平均回收率为92.5%～95.4%，相对标准偏差（RSD）為5.2%～7.3%，表明该方法重现性强、准确性高、回收率高，能够满足日常检测的要求。
2.5 实际样品检测
利用已建立的方法进行草鱼体内地西泮残留量的测定。试验表明，在一次鱼类药物残留大排查中，200个抽查样品中有7个草鱼样品检出地西泮，最高的残留量为20.7 μg/kg，该研究方法能够准确测定水产品中地西泮残留量。
3 结论
该研究采用分散固相萃取技术，通过对质谱、色谱、提取溶剂、净化条件的优化，结合UPLC-MS/MS 技术，建立了水产品中地西泮快速定量分析方法。分散固相萃取能够降低样品基质效应的影响。通过质谱的全扫描模式下的精确质量母离子作为定量离子，更适合样品中目标化合物的快速筛查。经实际样品检测确证，该方法快速、准确、灵敏，满足水产品中地西泮的检测分析。
参考文献
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关键词 水产品;分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱;地西泮;农药残留
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Determination of Diazepam in Aquatic Products by Dispersive Solid Phase Extraction Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
ZENG Jun jie1，2，CHEN Si1，ZHANG Xiao jun1 et al （1.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang，Zhoushan，Zhejiang 316021;2.Marine and Fishery Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316021）
Abstract [Objective]A method for the determination of diazepam pesticide residues in aquatic products by dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established.[Method]The samples were successively extracted by 1% ammonia water acetonitrile and 1% acetic acid acetonitrile，and purified by dispersive solid phase extraction with PSA∶C18∶anhydrous MgSO4=1∶0.5∶3 as adsorbent，C18 column （2.1 mm×100 mm，1.7 μ m） separation，0.1% formic acid 5 mmol/L ammonium acetate：methanol （90∶10） as the initial mobile phase，combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC MS/MS） for quantitative analysis.[Result]The recoveries of the added samples were 92.5%-95.4%，and the relative standard deviations （RSD） were 5.2%-7.3%.The detection limit was 1.0 μg/kg.[Conclusion]The sensitivity，precision and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of diazepam in aquatic products.
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目前地西泮的检测方法较多，主要有气相色谱-串联质谱法（GC-MS）[14-17]、高效液相色谱法（HPLC）[18-19]和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[20-22]等，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）拥有超高效液相快速、有效的分离能力和串联质谱的精准灵敏度，是一种快速发展的分析技术[23]。将超高效液相色谱-串联质谱法与分散固相萃取技术相结合[24]是目前比较流行的检测方式，兼具两者的优点，可以真正实现多种兽药残留的快速检测。该研究使用分散固相萃取技术进行前处理，超高效液相色谱-串联质谱法为检测方法，实现了地西泮残留的快速检测，为分散固相萃取前处理方式在水产品领域的应用提供更强的保障。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
地西泮（DXP）、氘代地西泮（DXP-D5），纯度均>98%， 美国Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸铵，色谱纯，德国Merck公司;MgSO4（分析纯）、氨水（分析纯）、PSA（粒径40～60 μm）、C18（粒径50 μm），上海国药集团。
1.2 仪器与设备
ACQUITYTM 超高效液相色谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），美国Waters公司; 3-30K 高速冷冻离心机，Sigma公司;MX-S 涡旋搅拌器，美国Scilogex公司;N-EVAP-112氮吹仪，美国Organomation公司。
1.3 溶液的制备
1.3.1 吸附剂的制备。取PSA、C18、MgSO4适量，按照1∶0.5∶3的比例混匀，放入烘箱烘干，备用。
1.3.2 標准曲线溶液的制备。分别准确称取1 mg地西泮和氘代地西泮固体标准物质，用甲醇溶解定容至100 mL，配成10 μg/mL的中间使用液，于-18 ℃下避光保存。中间使用液再次稀释，配制成100 ng/mL使用液，4 ℃避光备用。
1.4 UPLC-MS条件
1.4.1 色谱条件。ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱温40 ℃;样品室温度10 ℃;进样量1.0 μL;流动相为0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液（A）、甲醇（B）;流速0.3 mL/min;洗脱条件：0～0.5 min，10% B;0.5～2.5 min，30% B;2.5～5.0 min，95% B;5.0～7.5 min，95% B;7.5～1.0 min，10% B。
1.4.2 质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）;扫描方式为多反应监测（MRM）;毛细管电压3.2 kV;锥孔电压38 V;脱溶剂气温度380 ℃;离子源温度120 ℃;碰撞池压力0.003 hPa;锥孔气流量 50 L/h;干燥气体流速600 L/h。地西泮及其氘代物的质谱参数如表1所示。
1.5 样品前处理
1.5.1 提取。
称取样品1 g于15 mL离心管中，准确加入50 μL混合内标使用液，涡旋30 s。加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液、2.5 g 氯化钠，涡旋提取1 min，超声提取10 min，以6 000 r/min 离心5 min。收集上清液。剩余混合物中再加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液，重复提取1次，合并2次上清液，待净化。
1.5.2 净化。将吸附剂加入“1.5.1”提取液中，旋紧螺旋盖，高速涡旋1 min，6 000 r/min离心5 min。
1.5.3 浓缩、转溶。
合并所有有机相溶液，于40 ℃下氮气吹至干。准确加入1.0 mL 10%甲醇溶液溶解残渣，涡旋混合1 min，经0.22 μm滤膜过滤后上机检测。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
以20 μL/min的流速将标准溶液打入离子源，在正离子模式下进行扫描，对毛细管电压和锥孔电压进行优化，确定地西泮的毛细管电压、锥孔电压分别为3.2 kV和38 V。用二级质谱将母离子击碎，选取经碰撞后响应值较高的2个子离子分别为定量离子和定性离子，并进行优化，如图1所示。
2.2 色谱条件的优化
该试验以C18色谱柱作为色谱分析柱，分别选择乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈体系以及0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇体系作为流动相，发现乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但甲醇作为有机相时峰形比乙腈好，响应值高，同时在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol乙酸铵，改善了被待测物质的峰形，这是由于有机酸和挥发性盐提高了他们的分离度和离子化效率，图2～3为待测物质的色谱图。
2.3 前处理优化
2.3.1 提取条件的优化。
地西泮极性偏弱，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶剂，不溶于水。该试验选取1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈、乙酸乙酯和甲醇4种提取溶剂进行比较，4种溶剂提取效率如图4所示。
试验表明甲醇提取，地西泮回收率较好（93.9%），但部分油脂被萃取到提取液中，对仪器（UPLC-MS/MS）响应值有明显的抑制作用。1%氨水乙腈提取地西泮回收率91.7%，故选择乙腈超声10 min，提取2次保证提取率的最大化。
2.3.2 净化条件的选择。
目前，在对地西泮报道的已有文献中，多以HLB、C18等SPE净化柱为主，该试验以分散固相萃取为前处理方式，对MgSO4、HLB、PSA、C18以及吸附剂进行对比，净化效果见图5。结果表明弱阳离子（HLB、C18）等SPE柱净化回收率一般，回收率无法满足水产品检测的需求;MgSO4、PSA能够去除样品中的脂肪酸、糖类物质等不同杂质，平均回收率高于SPE的方法，并且净化效果明显，但回收率过低，也无法满足水产品的检测需求;混合吸附剂在除去大部分杂质的同时，回收率达到93.2%，符合水产品检测回收率70%～120%的要求，故选用混合吸附剂。
2.3.3 吸附剂使用量的优化。
分别将0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g 的PSA用于净化试验，比较PSA不同使用量的净化效果，结果如图6所示。试验表明，当PSA用量为0.2～0.8 g时，目标物质回收率在92%～95%，回收率均比较理想，但是考虑到伴随着使用量增加，杂质去除效率更好，因此选用使用量最大的。当使用量在逐渐增加，回收率明显降低，此时吸附剂足够吸附杂质，分析原因可能是吸附剂中PSA成分中氨基游离出来，与目标物质中某些基团发生化学反应。综上所述，选择PSA的使用量为0.8 g，既保证了净化后样品的纯净，又保证试验回收率满足试验方法。 2.4 方法学验证
2.4.1 检出限、定量限及线性关系。
取草鱼空白样品，按照“1.5”的前处理方法，得到空白基质溶液，配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的空白基质混合标准工作曲线，以待测物质的峰面积（y）和相应的浓度（x）绘制标准曲线，得出线性回归方程为y=0.659 359x-0.042 260 9（r=0.997），表明地西泮浓度在0.5～50.0 μg/L与峰面积的线性关系良好。根据7个空白样品的基线噪音求其平均值，按3倍信噪比计算其方法检测限（LOD），10倍信噪比计算其方法定量限（LOQ），该化合物检出限和定量限分别为0.5和1.0 μg/kg。
2.4.2 回收率和精密度。
通过加标回收试验来评价方法的准确性、精密度和回收率，标准曲线见图7。在前处理前，将混合标准溶液加至1 g草鱼基质中，然后按照“1.5”方法进行前处理。其中，混合标准工作液分为1.0、2.0、5.0 ng/mL这3个水平，每个平行测定3次。从表2可以看出，平均回收率为92.5%～95.4%，相对标准偏差（RSD）為5.2%～7.3%，表明该方法重现性强、准确性高、回收率高，能够满足日常检测的要求。
2.5 实际样品检测
利用已建立的方法进行草鱼体内地西泮残留量的测定。试验表明，在一次鱼类药物残留大排查中，200个抽查样品中有7个草鱼样品检出地西泮，最高的残留量为20.7 μg/kg，该研究方法能够准确测定水产品中地西泮残留量。
3 结论
该研究采用分散固相萃取技术，通过对质谱、色谱、提取溶剂、净化条件的优化，结合UPLC-MS/MS 技术，建立了水产品中地西泮快速定量分析方法。分散固相萃取能够降低样品基质效应的影响。通过质谱的全扫描模式下的精确质量母离子作为定量离子，更适合样品中目标化合物的快速筛查。经实际样品检测确证，该方法快速、准确、灵敏，满足水产品中地西泮的检测分析。
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