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摘要：【目的】以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因（HbHMGR1）乳管表达载体pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，获得抗性转基因材料，为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础。【方法】用根癌农杆菌EHA105介导表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织，经卡那霉素筛选数月后，对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测。【结果】经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4～6个月筛选，得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系；取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定，均能扩增出与阳性对照相同的特异片段，uidA、NPTII和PHEV2.1-
HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592 bp。2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定，发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带，而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带，包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列，其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列。【结论】将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中，可获得一个含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系。
关键词： 橡胶树；HbHMGR1基因；乳管特异性启动子PHEV2.1；易碎愈傷组织；遗传转化
中图分类号： S794.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0597-07
Abstract：【Objective】The laticifer expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 containing 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 gene（HbHMGR1） was constructed successfully， and transform friable embryogenic callus of rubber tree clone to obtain transgenic materials， in order to provide basis for studying specific expression of exogenous HbHMGR1 gene in laticifer and increasing rubber yield. 【Method】The expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 were transfered into friable embryogenic callus of elite rubber tree clone Reyan 8-79 by mediation of Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. Friable calluses were cultivated in subculture medium supplemented with 75 mg/L kanamycin for months. Then the kanamycin-resistant calluses were detected by GUS staining. 【Result】A total of 5 kanamycin-resistant friable embryogenic callus lines were obtained after screening of 4-6 months， and GUS detection showed that， they were positive. In addition， PCR identification results showed that， the specific DNA fragments could be amplified from resistant callus lines 2 and 11 as same as positive control， the target fragments of uidA， NPTII and PHEV2.1-HbHMGR1 were 829， 797 and 3592 bp in length， respectively. The inverse PCR（IPCR） identification results showed that， the positive fragments could not be amplified from line 2， while one band with the length of 2000 bp was amplified from the line 11， which contained T-DNA sequence and an unknown DNA sequence. Then this unknown DNA sequence was identified as a segment of continuous sequence of genome of rubber tree clone Reyan 8-79 by using genome database of rubber tree. 【Conclusion】The T-DNA region of plant expression vector is integrated into genome of resistant callus line， so as to obtain one transgenic callus line with 35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA. Key words： Hevea brasiliensis； HbHMGR1 gene； laticifer specific promoter PHEV2.1； friable callus； genetic transformation
0 引言
【研究意义】橡胶树是重要的热带经济作物，其产出的天然橡胶是重要战略物资（张志平等，2014）。近年来，随着国民经济和国防事业的快速发展，我国天然橡胶的自给率逐年下降，进口依赖度不断攀升（王少明，2011）。然而，橡胶树适种区域有限，通过扩大种植面积增加橡胶产量的潜力极小，因此开展橡胶树品种改良、提高橡胶单产的研究迫在眉睫。天然橡胶生物合成是影响橡胶树胶乳产量的重要因素（吴春太等，2009），改进其调控机理可能对提高橡胶树胶乳产量产生积极作用。橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1（HbHMGR1）是橡胶生物合成途径的关键限速酶（Chye et al.，1992；Venkatachalam et al.，2009），在非产胶植物中缺乏此酶，而HEV2.1基因启动子是乳管特异表达的强启动子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008），因此，利用HEV2.1基因启动子构建HbHMGR1基因的乳管特异性表达载体并转化橡胶树，对提高橡胶产量具有重要意义。【前人研究进展】2005年，Pujade-Renaud等成功克隆获得橡胶蛋白基因HEV2.1启动子（PHEV2.1），并发现其能驱动uidA基因在转基因水稻的许多组织中高水平表达。Montoro等（2008）利用转基因技术，发现PHEV2.1能驱动uidA基因在橡胶树乳管细胞中特异性表达。贺永国等（2016）克隆获得热研7-33-97的PHEV2.1，并构建了HbHMGR1的植物表达载体。天然橡胶生物合成是一种典型的类异戊二烯途径次生代谢（段翠芳等，2004），HbHMGR是该途径的关键限速酶。在橡胶树中存在HMGR基因家族，包含hmg1、hmg2和hmg3等3个基因。其中，hmg1（HbHMGR1）是橡胶树特有基因，在非产胶植物中缺乏相应基因成员，主要在乳管中特异性表达，且由乙烯诱导，其编码的酶被认为参与了橡胶生物合成；hmg3基因的表达不受乙烯影响，其作为“看家”基因在组织中呈组成型表达，无细胞类型特异性；hmg2和hmg3基因未参与橡胶生物合成，编码的酶參与类异戊二烯的生物合成（Chye et al.，1991， 1992）。在非产胶植物拟南芥中，HMGR是由2个差异表达的基因所编码，其中HMG2基因的表达仅限于分生组织（根尖和茎尖）和花组织（Enjuto et al.，1995）。Lynen（1969）曾对橡胶生物合成途径所涉及的9种酶进行活性测定，结果表明，HMGR活性远低于其他酶，约为其他酶活性的1/1000，是橡胶生物合成的限速酶。Schaller等（1995）研究发现，转橡胶树HbHMGR1基因烟草的甾醇含量比对照提高了6倍。Dong等（2013）也研究发现，转构巢曲霉HMGR的部分银胶菊表现出胶乳产量增加，有力佐证了HMGR是类异戊二烯合成途径的关键限速酶。马晓晓等（2014）通过克隆橡胶树品种热研7-33-97的HbHMGR1基因，然后与CaMV35S组成型启动子连接，构建植物表达载体，再转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，最终获得转HbHMGR1基因易碎愈伤组织系，且发现HbHMGR1基因在愈伤组织阶段即开始表达。【本研究切入点】尽管已有PHEV2.1和HbHMGR1基因的研究报道，但尚无利用PHEV2.1构建HbHMGR1基因乳管特异性表达载体转化橡胶树的研究报道。【拟解决的关键问题】以橡胶树花药易碎愈伤组织为受体材料，用根癌农杆菌介导乳管特异性表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1进行遗传转化，以期获得转基因植株，为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
转化所用植物受体材料为橡胶树品种热研8-79的花药易碎胚性愈伤组织，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。乳管特异性表达载体pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1和根癌农杆菌EHA105由农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室提供。氨苄青霉素、卡那霉素、利福平、链霉素等抗生素购自北京索莱宝公司；DL2000 DNA Marker、T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取及纯化试剂盒购自美国Omega公司；限制性内切酶购自美国NEB公司；其他试剂为国产分析纯。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化农杆菌 根癌农杆菌EHA105转化采用冻融法，感受态细胞的制备参照魏琦超和畅丽萍（2009）的方法。取1管根癌农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上溶解，向菌液中加入0.5 μg重组质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轻轻振荡混匀，冰浴30 min；液氮中速冻1 min，然后37 ℃温育5 min；取出样品，迅速置于冰上冷却5 min；加入1 mL无抗生素的LB液体培养基，28 ℃下摇床（100 r/min）培养4 h；再5000 r/min离心5 min，收集菌体，悬浮于300 μL的LB液体培养基中；将转化细胞均匀涂抹在含有50 mg/L Rif和50 mg/L Str的LA固体培养基上，28 ℃培养2～3 d；菌落长出后，用特异引物PHF1/H1R（5'-GCTCTAGAA
TGGACACCACCGGCC-3'和5'-CCCCCCGGGCTAAG
ATGCAGCTTTAGAC-3'）对单菌落进行PCR扩增（贺永国等，2016）。选取PCR检测呈阳性的菌株用于制备工程菌。 1. 2. 2 橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养 转化所用植物受体材料热研8-79花药易碎胚性愈伤组织的诱导及培养参照李哲等（2010）的方法，将从花药诱导获得的紧致愈伤组织置于高钙离子浓度（11.0 mmol/L）的继代培养基中继代培养，每隔20 d继代1次，经过5次以上的继代后，筛选出适合长期继代培养的易碎胚性愈伤组织。
1. 2. 3 花药易碎胚性愈伤组织的转化及GUS组织化学染色 参照Blanc等（2006）的方法进行易碎胚性愈伤组织转化。将易碎胚性愈伤组织置于无钙离子的继代培养基中预培养一段时间后（Montoro et al.，2003），对愈伤组织进行侵染、共培养、抑菌和筛选，然后参照马晓晓等（2014）的方法将筛选获得的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色，选取呈GUS染色阳性的抗性愈伤组织继续继代培养增殖，形成愈伤组织系，以便用于后续的分子检测和体细胞胚发生。
1. 2. 4 抗性愈伤组织的PCR检测 以非抗性愈伤组织和筛选6个月以上的抗性愈伤组织为材料，分别提取基因组DNA；根据T-DNA上uidA、NPTII和PHEV2.1- HbHMGR1的序列，用Primer 5.0各设计1对特异引物，引物分别命为UF/UR（5'-GCGAAGTCTTTATACCGA
AAGGTTG-3'和5'-ACGATGCCATGTTCATCTGCCC
AG-3'）、NPT-F/NPT-R（5'-TCAGAAGAACTCGTCAA
GAAG-3'和5'-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3'）、PHHF/PHHR（5'-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAG
GTGACC-3'和5'-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCT
TTAGAC-3'），3对引物扩增的目的片段大小分别为829、797和3592 bp。
1. 2. 5 反向PCR扩增抗性愈伤组织外源基因插入位点的左旁侧序列 根据植物表达载体的T-DNA序列，在T-DNA内部的EcoRⅠ至左边界（TL）的序列上设计1对反向引物Eco-F/TL-R（5'-CTGCTCTAGCCAA
TACGCAAACC-3'和5'-GTGAGTAGTTCCCAGATAA
GGGAAT-3'）；抗性愈伤组织的基因组DNA经过一系列的酶切、纯化和T4 DNA连接酶环化后，以环化产物为模板，以Eco-F/TL-R为引物进行反向PCR扩增，3次重复；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果提交至橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库进行同源性分析，验证其是否为橡胶树基因组上的片段。
2 结果与分析
2. 1 植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化根癌农杆菌
将表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化根癌农杆菌EHA105，在含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L链霉素的LA培养基上培养36～48 h后，挑取5个单菌落进行PCR扩增，检测结果均为阳性（图1），表明植物表达载体pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1已成功转化至根癌农杆菌中。
2. 2 抗性愈伤组织的GUS染色鉴定结果
以含表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的根癌农杆菌侵染橡胶树品种热研8-79的花药易碎胚性愈伤组织，经4～6个月筛选，得到5个GUS组织化学染色呈阳性的卡那霉素抗性愈伤组织系。图2为其中一个抗性愈伤组织系的GUS染色结果，表明植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的T-DNA序列已成功转入易碎愈伤组织细胞中。
2. 3 抗性愈伤组织PCR检测结果
从筛选获得的5个抗性愈伤组织系中挑選增殖较多的2个组织系，分别提取其基因组DNA，以非转化愈伤组织系基因组DNA为阴性对照，以植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1为阳性对照，用uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的特异引物进行PCR扩增，每系重复2次。结果发现，从2个抗性愈伤组织系均能扩增出与阳性对照相同的特异片段，其目的片段大小分别为829（图3）、797（图4）和3592 bp（图5）。
2. 4 反向PCR扩增转化愈伤组织T-DNA左旁侧序列
反向PCR鉴定结果表明，2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带，而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带（图6）。对从11号抗性愈伤组织系反向PCR扩增所得的片段进行测序鉴定，结果显示该片段为1803 bp，其中包含反向引物扩增到的T-DNA序列和一段未知的DNA序列（1303 bp）（图7）。未知DNA序列经橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库进行同源性分析，结果发现在热研7-33-97基因组中存在一段与未知DNA序列高度同源的连续序列[scaffold0878（117328-118630）]，二者的同源性为98.7%，证明所获得的未知片段为橡胶树基因组的一段连续序列，植物表达载体的T-DNA序列已成功整合到橡胶树品种热研8-79的染色体上，即11号抗性愈伤组织系为转基因愈伤组织系。
3 讨论
目前，NCBI上关于天然橡胶HbHMGR1基因有3条序列，GenBank登录号分别为AY706757.1、X54659.1和AB294692.1，其中X54659.1来源于橡胶品种RRIM 600，AY706757.1来源于橡胶品种RRII 105，AB294692.1来源于橡胶品种RRIM 600，彼此间仅有1～2个碱基差异。X54659.1和AB294692.1的第1031位碱基均为G，为PstⅠ酶切位点[ctgcag（1029…1034）]，而AY706757.1的第1031位碱基为A，非PstⅠ酶切位点[ctacag（1029…1034）]。X54659.1和AY706757.1的DNA序列相似率为99.9%，其编码蛋白质序列差异在第344位氨基酸残基，X54659.1为半胱氨酸（Cys），而AY706757.1Y为酪氨酸（Tyr），其他氨基酸残基相同，蛋白质序列相似率为99.8%。本课题组曾根据已报道的HbHMGR1基因序列（GenBank登录号X54659.1）设计特异引物，以橡胶优良品种热研7-33-97胶乳为材料，通过反向PCR克隆HbHMGR1基因，并委托深圳华大基因公司进行测序，结果表明，目的片段大小为1728 bp，与X54659.1的HbHMGR1基因核苷酸序列相比，同源性达100%（马晓晓等2014）；同时委托生工生物工程（上海）股份有限公司将X54659.1的第1031位碱基由G点突变为A，致使PstⅠ酶切位点消失，以利于后续的植物表达载体构建研究。 在植物转基因研究中，反向PCR已成为检测转基因植物的一种重要手段（张雨丽等，2014），现已广泛应用于烟草（Does et al.，1991）、水稻（章冰和卫志明，1999；韩志勇等，2001）和油菜（杨坤等，2010；申爱娟等，2014）等植物，但在橡胶树中的应用尚无报道。本研究利用该技术成功从橡胶树卡那霉素抗性愈伤组织系基因组DNA中克隆获得外源T-DNA整合位点的左旁侧序列，并证实筛选得到的抗性愈伤组织系为转基因愈伤组织系，为今后利用该技术检测橡胶树转基因材料提供新的途径。另外，在对反向PCR扩增获得的序列进行分析时，发现整合T-DNA的左边界及靠近左边界的一段T-DNA序列完全缺失，与Fang等（2000）分析转基因水稻T-DNA左旁侧序列的结果一致，进一步证实筛选得到的抗性愈伤组织系即为转基因愈伤组织系。
4 结论
本研究结果表明，将表达载体的T-DNA整合到橡胶树品种热研8-79的卡那霉素抗性愈伤组织系基因组DNA中，能获得一个含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系。
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（責任编辑 兰宗宝）
HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592 bp。2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定，发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带，而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带，包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列，其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列。【结论】将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中，可获得一个含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系。
关键词： 橡胶树；HbHMGR1基因；乳管特异性启动子PHEV2.1；易碎愈傷组织；遗传转化
中图分类号： S794.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0597-07
Abstract：【Objective】The laticifer expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 containing 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 gene（HbHMGR1） was constructed successfully， and transform friable embryogenic callus of rubber tree clone to obtain transgenic materials， in order to provide basis for studying specific expression of exogenous HbHMGR1 gene in laticifer and increasing rubber yield. 【Method】The expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 were transfered into friable embryogenic callus of elite rubber tree clone Reyan 8-79 by mediation of Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. Friable calluses were cultivated in subculture medium supplemented with 75 mg/L kanamycin for months. Then the kanamycin-resistant calluses were detected by GUS staining. 【Result】A total of 5 kanamycin-resistant friable embryogenic callus lines were obtained after screening of 4-6 months， and GUS detection showed that， they were positive. In addition， PCR identification results showed that， the specific DNA fragments could be amplified from resistant callus lines 2 and 11 as same as positive control， the target fragments of uidA， NPTII and PHEV2.1-HbHMGR1 were 829， 797 and 3592 bp in length， respectively. The inverse PCR（IPCR） identification results showed that， the positive fragments could not be amplified from line 2， while one band with the length of 2000 bp was amplified from the line 11， which contained T-DNA sequence and an unknown DNA sequence. Then this unknown DNA sequence was identified as a segment of continuous sequence of genome of rubber tree clone Reyan 8-79 by using genome database of rubber tree. 【Conclusion】The T-DNA region of plant expression vector is integrated into genome of resistant callus line， so as to obtain one transgenic callus line with 35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA. Key words： Hevea brasiliensis； HbHMGR1 gene； laticifer specific promoter PHEV2.1； friable callus； genetic transformation
0 引言
【研究意义】橡胶树是重要的热带经济作物，其产出的天然橡胶是重要战略物资（张志平等，2014）。近年来，随着国民经济和国防事业的快速发展，我国天然橡胶的自给率逐年下降，进口依赖度不断攀升（王少明，2011）。然而，橡胶树适种区域有限，通过扩大种植面积增加橡胶产量的潜力极小，因此开展橡胶树品种改良、提高橡胶单产的研究迫在眉睫。天然橡胶生物合成是影响橡胶树胶乳产量的重要因素（吴春太等，2009），改进其调控机理可能对提高橡胶树胶乳产量产生积极作用。橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1（HbHMGR1）是橡胶生物合成途径的关键限速酶（Chye et al.，1992；Venkatachalam et al.，2009），在非产胶植物中缺乏此酶，而HEV2.1基因启动子是乳管特异表达的强启动子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008），因此，利用HEV2.1基因启动子构建HbHMGR1基因的乳管特异性表达载体并转化橡胶树，对提高橡胶产量具有重要意义。【前人研究进展】2005年，Pujade-Renaud等成功克隆获得橡胶蛋白基因HEV2.1启动子（PHEV2.1），并发现其能驱动uidA基因在转基因水稻的许多组织中高水平表达。Montoro等（2008）利用转基因技术，发现PHEV2.1能驱动uidA基因在橡胶树乳管细胞中特异性表达。贺永国等（2016）克隆获得热研7-33-97的PHEV2.1，并构建了HbHMGR1的植物表达载体。天然橡胶生物合成是一种典型的类异戊二烯途径次生代谢（段翠芳等，2004），HbHMGR是该途径的关键限速酶。在橡胶树中存在HMGR基因家族，包含hmg1、hmg2和hmg3等3个基因。其中，hmg1（HbHMGR1）是橡胶树特有基因，在非产胶植物中缺乏相应基因成员，主要在乳管中特异性表达，且由乙烯诱导，其编码的酶被认为参与了橡胶生物合成；hmg3基因的表达不受乙烯影响，其作为“看家”基因在组织中呈组成型表达，无细胞类型特异性；hmg2和hmg3基因未参与橡胶生物合成，编码的酶參与类异戊二烯的生物合成（Chye et al.，1991， 1992）。在非产胶植物拟南芥中，HMGR是由2个差异表达的基因所编码，其中HMG2基因的表达仅限于分生组织（根尖和茎尖）和花组织（Enjuto et al.，1995）。Lynen（1969）曾对橡胶生物合成途径所涉及的9种酶进行活性测定，结果表明，HMGR活性远低于其他酶，约为其他酶活性的1/1000，是橡胶生物合成的限速酶。Schaller等（1995）研究发现，转橡胶树HbHMGR1基因烟草的甾醇含量比对照提高了6倍。Dong等（2013）也研究发现，转构巢曲霉HMGR的部分银胶菊表现出胶乳产量增加，有力佐证了HMGR是类异戊二烯合成途径的关键限速酶。马晓晓等（2014）通过克隆橡胶树品种热研7-33-97的HbHMGR1基因，然后与CaMV35S组成型启动子连接，构建植物表达载体，再转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，最终获得转HbHMGR1基因易碎愈伤组织系，且发现HbHMGR1基因在愈伤组织阶段即开始表达。【本研究切入点】尽管已有PHEV2.1和HbHMGR1基因的研究报道，但尚无利用PHEV2.1构建HbHMGR1基因乳管特异性表达载体转化橡胶树的研究报道。【拟解决的关键问题】以橡胶树花药易碎愈伤组织为受体材料，用根癌农杆菌介导乳管特异性表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1进行遗传转化，以期获得转基因植株，为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
转化所用植物受体材料为橡胶树品种热研8-79的花药易碎胚性愈伤组织，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。乳管特异性表达载体pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1和根癌农杆菌EHA105由农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室提供。氨苄青霉素、卡那霉素、利福平、链霉素等抗生素购自北京索莱宝公司；DL2000 DNA Marker、T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取及纯化试剂盒购自美国Omega公司；限制性内切酶购自美国NEB公司；其他试剂为国产分析纯。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化农杆菌 根癌农杆菌EHA105转化采用冻融法，感受态细胞的制备参照魏琦超和畅丽萍（2009）的方法。取1管根癌农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上溶解，向菌液中加入0.5 μg重组质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轻轻振荡混匀，冰浴30 min；液氮中速冻1 min，然后37 ℃温育5 min；取出样品，迅速置于冰上冷却5 min；加入1 mL无抗生素的LB液体培养基，28 ℃下摇床（100 r/min）培养4 h；再5000 r/min离心5 min，收集菌体，悬浮于300 μL的LB液体培养基中；将转化细胞均匀涂抹在含有50 mg/L Rif和50 mg/L Str的LA固体培养基上，28 ℃培养2～3 d；菌落长出后，用特异引物PHF1/H1R（5'-GCTCTAGAA
TGGACACCACCGGCC-3'和5'-CCCCCCGGGCTAAG
ATGCAGCTTTAGAC-3'）对单菌落进行PCR扩增（贺永国等，2016）。选取PCR检测呈阳性的菌株用于制备工程菌。 1. 2. 2 橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养 转化所用植物受体材料热研8-79花药易碎胚性愈伤组织的诱导及培养参照李哲等（2010）的方法，将从花药诱导获得的紧致愈伤组织置于高钙离子浓度（11.0 mmol/L）的继代培养基中继代培养，每隔20 d继代1次，经过5次以上的继代后，筛选出适合长期继代培养的易碎胚性愈伤组织。
1. 2. 3 花药易碎胚性愈伤组织的转化及GUS组织化学染色 参照Blanc等（2006）的方法进行易碎胚性愈伤组织转化。将易碎胚性愈伤组织置于无钙离子的继代培养基中预培养一段时间后（Montoro et al.，2003），对愈伤组织进行侵染、共培养、抑菌和筛选，然后参照马晓晓等（2014）的方法将筛选获得的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色，选取呈GUS染色阳性的抗性愈伤组织继续继代培养增殖，形成愈伤组织系，以便用于后续的分子检测和体细胞胚发生。
1. 2. 4 抗性愈伤组织的PCR检测 以非抗性愈伤组织和筛选6个月以上的抗性愈伤组织为材料，分别提取基因组DNA；根据T-DNA上uidA、NPTII和PHEV2.1- HbHMGR1的序列，用Primer 5.0各设计1对特异引物，引物分别命为UF/UR（5'-GCGAAGTCTTTATACCGA
AAGGTTG-3'和5'-ACGATGCCATGTTCATCTGCCC
AG-3'）、NPT-F/NPT-R（5'-TCAGAAGAACTCGTCAA
GAAG-3'和5'-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3'）、PHHF/PHHR（5'-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAG
GTGACC-3'和5'-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCT
TTAGAC-3'），3对引物扩增的目的片段大小分别为829、797和3592 bp。
1. 2. 5 反向PCR扩增抗性愈伤组织外源基因插入位点的左旁侧序列 根据植物表达载体的T-DNA序列，在T-DNA内部的EcoRⅠ至左边界（TL）的序列上设计1对反向引物Eco-F/TL-R（5'-CTGCTCTAGCCAA
TACGCAAACC-3'和5'-GTGAGTAGTTCCCAGATAA
GGGAAT-3'）；抗性愈伤组织的基因组DNA经过一系列的酶切、纯化和T4 DNA连接酶环化后，以环化产物为模板，以Eco-F/TL-R为引物进行反向PCR扩增，3次重复；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果提交至橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库进行同源性分析，验证其是否为橡胶树基因组上的片段。
2 结果与分析
2. 1 植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化根癌农杆菌
将表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化根癌农杆菌EHA105，在含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L链霉素的LA培养基上培养36～48 h后，挑取5个单菌落进行PCR扩增，检测结果均为阳性（图1），表明植物表达载体pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1已成功转化至根癌农杆菌中。
2. 2 抗性愈伤组织的GUS染色鉴定结果
以含表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的根癌农杆菌侵染橡胶树品种热研8-79的花药易碎胚性愈伤组织，经4～6个月筛选，得到5个GUS组织化学染色呈阳性的卡那霉素抗性愈伤组织系。图2为其中一个抗性愈伤组织系的GUS染色结果，表明植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的T-DNA序列已成功转入易碎愈伤组织细胞中。
2. 3 抗性愈伤组织PCR检测结果
从筛选获得的5个抗性愈伤组织系中挑選增殖较多的2个组织系，分别提取其基因组DNA，以非转化愈伤组织系基因组DNA为阴性对照，以植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1为阳性对照，用uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的特异引物进行PCR扩增，每系重复2次。结果发现，从2个抗性愈伤组织系均能扩增出与阳性对照相同的特异片段，其目的片段大小分别为829（图3）、797（图4）和3592 bp（图5）。
2. 4 反向PCR扩增转化愈伤组织T-DNA左旁侧序列
反向PCR鉴定结果表明，2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带，而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带（图6）。对从11号抗性愈伤组织系反向PCR扩增所得的片段进行测序鉴定，结果显示该片段为1803 bp，其中包含反向引物扩增到的T-DNA序列和一段未知的DNA序列（1303 bp）（图7）。未知DNA序列经橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库进行同源性分析，结果发现在热研7-33-97基因组中存在一段与未知DNA序列高度同源的连续序列[scaffold0878（117328-118630）]，二者的同源性为98.7%，证明所获得的未知片段为橡胶树基因组的一段连续序列，植物表达载体的T-DNA序列已成功整合到橡胶树品种热研8-79的染色体上，即11号抗性愈伤组织系为转基因愈伤组织系。
3 讨论
目前，NCBI上关于天然橡胶HbHMGR1基因有3条序列，GenBank登录号分别为AY706757.1、X54659.1和AB294692.1，其中X54659.1来源于橡胶品种RRIM 600，AY706757.1来源于橡胶品种RRII 105，AB294692.1来源于橡胶品种RRIM 600，彼此间仅有1～2个碱基差异。X54659.1和AB294692.1的第1031位碱基均为G，为PstⅠ酶切位点[ctgcag（1029…1034）]，而AY706757.1的第1031位碱基为A，非PstⅠ酶切位点[ctacag（1029…1034）]。X54659.1和AY706757.1的DNA序列相似率为99.9%，其编码蛋白质序列差异在第344位氨基酸残基，X54659.1为半胱氨酸（Cys），而AY706757.1Y为酪氨酸（Tyr），其他氨基酸残基相同，蛋白质序列相似率为99.8%。本课题组曾根据已报道的HbHMGR1基因序列（GenBank登录号X54659.1）设计特异引物，以橡胶优良品种热研7-33-97胶乳为材料，通过反向PCR克隆HbHMGR1基因，并委托深圳华大基因公司进行测序，结果表明，目的片段大小为1728 bp，与X54659.1的HbHMGR1基因核苷酸序列相比，同源性达100%（马晓晓等2014）；同时委托生工生物工程（上海）股份有限公司将X54659.1的第1031位碱基由G点突变为A，致使PstⅠ酶切位点消失，以利于后续的植物表达载体构建研究。 在植物转基因研究中，反向PCR已成为检测转基因植物的一种重要手段（张雨丽等，2014），现已广泛应用于烟草（Does et al.，1991）、水稻（章冰和卫志明，1999；韩志勇等，2001）和油菜（杨坤等，2010；申爱娟等，2014）等植物，但在橡胶树中的应用尚无报道。本研究利用该技术成功从橡胶树卡那霉素抗性愈伤组织系基因组DNA中克隆获得外源T-DNA整合位点的左旁侧序列，并证实筛选得到的抗性愈伤组织系为转基因愈伤组织系，为今后利用该技术检测橡胶树转基因材料提供新的途径。另外，在对反向PCR扩增获得的序列进行分析时，发现整合T-DNA的左边界及靠近左边界的一段T-DNA序列完全缺失，与Fang等（2000）分析转基因水稻T-DNA左旁侧序列的结果一致，进一步证实筛选得到的抗性愈伤组织系即为转基因愈伤组织系。
4 结论
本研究结果表明，将表达载体的T-DNA整合到橡胶树品种热研8-79的卡那霉素抗性愈伤组织系基因组DNA中，能获得一个含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系。
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（責任编辑 兰宗宝）