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【摘 要】目的：通过血小板衍生生长因子（PDGF-B）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-a（TGF-a）和8-Br-cAMP共培养对多囊卵巢综合征（PCOS）患者离体卵巢黄素化颗粒细胞雌二醇（E2）生成的影响，探讨PDGF-B在多囊卵巢形成中的作用。方法：收集体外受精-胚胎移植（IVF-ET）时PC0S患者的卵巢黄素化颗粒细胞进行体外原代培养，在培养0、48、120 h时以睾酮（10-7mol/L）作为底物，分别添加剂量相同的（10?g/L）PDGF-B和TGF-a（A组）；PDGF-B和8-Br-cAMP （B组）；PDGF-B和EGF（C组）；PDGF-B、TGF-a和EGF（D组）；PDGF-B、EGF、TGF-a和8-Br-cAMP （E组）于无血清培养液中，培养3 h，收集培养上清，用放射免疫法测定E2含量。以不加任何细胞因子为空白对照。结果：与空白对照比较，PCOS患者颗粒细胞经四种因子共同培养，A组在Oh和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；B组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；C组在0h和120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；D组在120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；E组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）。结论：PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP共同作用，增加PCOS患者颗粒细胞E2的分泌，PDGF-B可能与多囊卵巢的形成有关。
【关键词】多囊卵巢综合征；血小板衍生生长因子；表皮生长因子；转化生长因子-a；8-Br-cAMP；颗粒细胞；多囊卵巢
【中图分类号】R711.75 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0160-02
随着生活环境的污染和工作压力的增加，多囊卵巢综合征（Polycystic Ovarian Syndmme，PCOS）的发病率逐年递增，占育龄妇女的6-8 %[1]，以持续不排卵和雄激素增高为主要特征。血小板衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor-B，PDGF-B）、转化生长因子-a（Transformation Growth Factor-a，TGF-a）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）和8-Br-cAMP在PCOS发病机制中占有非常重要的地位[2-4]。本研究将PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP分别与PCOS患者离体颗粒细胞共培养，观察不同时间对雌激素（E2）分泌的影响，探讨PDGF-B与TGF-a、EGF和8-Br-cAMP在PCOS患者多囊卵巢发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择2004年3月至2005年3月在郑州大学第三附属医院生殖医学中心行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者6例。均符合人民卫生出版社《妇产科学》第6版PCOS的诊断标准。超促排卵方案均采用长方案即促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）加高纯促性腺激素（rFSH）。未用其他激素类药物，排除子宫内膜异位症以及其他内分泌疾病。年龄26.0-31.0 （28.1±2.3）岁，体质指数（BMI）19.0—23.5（21.2±2.4）kg/m2。
1.2 颗粒细胞的分离和培养 6例患者进行长方案超促排卵，当主导卵泡≥18mm时，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，丽珠制药厂） 后36 h，在B超引导下经阴道取卵时留取卵泡液，卵泡液缓慢叠加在淋巴细胞分离液上（卵泡液与淋巴细胞分离液体积比为1：1），2000 r/min离心10min，取中间层颗粒细胞，用3～5mL TCMl99培养基混匀，2000 r/min离心l0min，弃上清，沉淀加入含体积分数10%小牛血清TCM 199lmL，用巴斯德管反复吹打10 min。台盼蓝染色后用细胞计数器行颗粒细胞计数（90%以上为活细胞），以40～80?L-1接种于48孔培养板中，每孔250?L，置37℃、體积分数5%CO2培养箱中培养，每48 h更换培养液。培养48、120 h，倒置显微镜下观察细胞形态。
1.3 PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP对人颗粒细胞E2合成的影响 以10?L睾酮（10-7 mol/L）作为底物，分5组培养。每组分别添加等同剂量的（10?g/L）细胞因子，A组为 PDGF-BB（Sigma， USA）和TGF-a（Sigma， USA）；B组添加PDGF-B和8-Br-cAMP（Sigma， USA）；PDGF-B和EGF（C组）；PDGF-B、EGF和TGF-a（D组）；PDGF-B、EGF、TGF-a和8-Br-cAMP，共孵育3 h，在与颗粒细胞共孵育后的0、48、120 h，收集上清液于Eppendorf管中， -20℃冻存待测。以不加任何细胞因子为空白对照。重复3孔。颗粒细胞孵育液E2含量采用考马斯亮蓝G250/BSA法测定，试剂盒由天津九鼎公司提供。吸去上清液后的培养孔，加入0.1mol/L NaOH 50?L， 消化贴壁细胞，收集于Eppendorf管中， -20℃冻存，待测蛋白质含量，以校正E2分泌量测定结果。
1.4 统计学处理 结果以均数±标准差（ ）或率（%）表示，采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学处理，均数组间比较用t 检验；率的差异性分析采用X2检验；组间比较采用方差分析，以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 颗粒细胞体外生存情况 黄素化颗粒细胞24h内贴壁。倒置显微镜下观察原代培养48、120h颗粒细胞，均呈椭圆形或星形生长，细胞间有延长的丝状突起相互连接，胞核大、圆，胞质富含颗粒及空泡。
2.2 PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP 在与颗粒细胞共孵育的不同时间对E2分泌的影响 与空白对照比较，PCOS患者颗粒细胞经四种因子共同培养，A组在Oh和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；B组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；C组在0h和120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；D组在120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；E组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），见表1。 3 讨论
PCOS是不孕妇女排卵障碍的主要致病原因，发病机制不清楚。卵巢局部的生长因子在PCOS卵泡发育受阻、甾体激素分泌异常以及高胰岛素血症这一过程中扮演了重要的角色。PDGF-B家族由四个成员组成，包括 PDGF-B-A， -B， -C 和 -D，可以被PDGF-BR-α和PDGF-BR-β酪氨酸酶受体识别 ，PDGF-B在新血管形成、细胞外基质代谢、肺纤维化、肝硬化、胰腺纤维化等过程中具有重要作用[5-6]。
我们先前的研究结果表明，PCOS患者血清中PDGF-B含量和正常对照组比较没有统计学差异，而在卵泡液中的含量显著增高[4]。PCOS患者体外颗粒细胞培养发现，在高雄激素环境下，PDGF-B可以显著增加0h、48h和120h颗粒细胞E2的分泌[3]。有研究表明，雌激素可以通过PDGF介导的Akt通路，加重血管平滑肌脂肪瘤和淋巴血管平滑肌瘤的形成[7] ；雌激素受体的高表达与子宫内膜息肉的发生有关[8]。而PDGF-B和多囊肾的发生有关[9]，另外，PDGF-B在胰腺间质、纤维化区、炎症细胞浸润区表达增强[6]。本研究中卵泡液的PDGF-B与雌激素均升高，提示PDGF-B可能在多囊卵巢基质纤维化形成过程中具有重要作用。
TGF-a、EGF同是生长因子，均是强有力的有丝分裂原，可促进细胞的增殖与分化，产生多种生物学效应。研究证明，TGF-a和EGF在PCOS患者卵泡液的表达异常[2-3]。EGF显著抑制PCOS患者颗粒细胞分泌E2[3]。PCOS患者卵巢局部TGF-a、EGF活性增强，可能参与阻断芳香化酶的刺激和延缓卵泡凋亡，和其他细胞因子如胰岛素样因子系统相互作用，阻碍主导卵泡的出现和非主导卵泡的凋亡[10]。我们的研究结果表明，PDGF-B和TGF-a或EGF共孵育，可以显著增加颗粒细胞0h和120h E2分泌量（P <0.05），三者共培养，则只增加120h E2分泌量（P <0.05），说明TGF-a和EGF抑制E2分泌作用较短暂且迅速，PDGF-B作用时间持久，可能在阻碍主导卵泡的出现和非主导卵泡的凋亡中有重要作用。
8-Br-cAMP是第二信使类似物，可以直接通过扩散方式进入细胞内发挥作用。8-Br-cAMP在PCOS患者高雄激素环境下，可以显著增加0h、48h和120h颗粒细胞E2的分泌[2]。PDGF-B与8-Br-cAMP共孵育，在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），而0h没有显著影响。PDGF-B、TGF-a和EGF共孵育，增加120h E2分泌量（P <0.05）。将PDGF-B、TGF-a 、EGF和8-Br-cAMP共孵育，在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），而0h没有显著影响。说明PDGF-B与8-Br-cAMP在最初的共培养中对E2分泌有竞争抑制作用，可能通过某种共同的途径刺激E2分泌。
总之，PDGF-B刺激多囊卵巢综合征患者颗粒细胞E2分泌，与TGF-a 、EGF和8-Br-cAMP共孵育最终能促进颗粒细胞E2分泌，PDGF-B与雌激素的增高均与基质纤维化的形成有关，推测PDGF-B可能在刺激卵泡基质纤维化的形成过程中有重要作用。PDGF-B在多囊卵巢形成中的具体作用仍然不十分清楚，需要进一步的研究和探讨。
参考文献：
[1] March WA， Moore VM， Willson KJ， et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria[J]. Hum Reprod 2010， 25：544-551
[2] 贾丽婷， 张展， 王雪梅等. 8-Br-cAMP和血小板衍生生长因子对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞E2生成的影晌[J].郑州大学学报（医学版）.2006，41（2）：290-292.
[3] 王雪梅， 張展， 贾莉婷等. 血小板衍生生长因子和表皮生长因子对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞雌二醇生成的影响[J]. 郑州大学学报（医学版）. 2008，43（4）：645-648.
[4] 王雪梅， 张展， 贾莉婷. PDGF-B和EGF在多囊卵巢综合征中的表达[J]. 中国妇幼保健，2005，20（22）：2981-2982.
[5] Andrae J.， Gallini R.， Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J]. Genes Dev， 2008， 22， 1276-1312.
[6] 王东盛. PDGF及其受体在慢性胰腺炎胰腺纤维化机制中的作用及其对策的研究[学位论文].2006， 山东大学： 消化内科学
[7] Clements D， Asprey SL， McCulloch TA，et al.Analysis of the oestrogen response in an angiomyolipoma derived xenograft model[J]. Endocr Relat Cancer， 2009， 16（1）：59-72.
[8] 刘瑾. 雌孕激素受体及细胞色素芳香化酶在绝经前妇女子宫内膜息肉中的表达[学位论文]. 2010， 中山大学： 妇产科学.
[9] Nakamura T， Ebihara I， Nagaoka I， et al. Growth factor gene expression in kidney of murine polycystic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol. 1993 ， 3（7）：1378-1386.
[10] Homburg R.Involvement of growth factors in the pathophysiology of polycystic ovary syndrome[J]. Gynecol Endocrinol， 1998， 12（6）：391-397.
【关键词】多囊卵巢综合征；血小板衍生生长因子；表皮生长因子；转化生长因子-a；8-Br-cAMP；颗粒细胞；多囊卵巢
【中图分类号】R711.75 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0160-02
随着生活环境的污染和工作压力的增加，多囊卵巢综合征（Polycystic Ovarian Syndmme，PCOS）的发病率逐年递增，占育龄妇女的6-8 %[1]，以持续不排卵和雄激素增高为主要特征。血小板衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor-B，PDGF-B）、转化生长因子-a（Transformation Growth Factor-a，TGF-a）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）和8-Br-cAMP在PCOS发病机制中占有非常重要的地位[2-4]。本研究将PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP分别与PCOS患者离体颗粒细胞共培养，观察不同时间对雌激素（E2）分泌的影响，探讨PDGF-B与TGF-a、EGF和8-Br-cAMP在PCOS患者多囊卵巢发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择2004年3月至2005年3月在郑州大学第三附属医院生殖医学中心行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者6例。均符合人民卫生出版社《妇产科学》第6版PCOS的诊断标准。超促排卵方案均采用长方案即促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）加高纯促性腺激素（rFSH）。未用其他激素类药物，排除子宫内膜异位症以及其他内分泌疾病。年龄26.0-31.0 （28.1±2.3）岁，体质指数（BMI）19.0—23.5（21.2±2.4）kg/m2。
1.2 颗粒细胞的分离和培养 6例患者进行长方案超促排卵，当主导卵泡≥18mm时，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，丽珠制药厂） 后36 h，在B超引导下经阴道取卵时留取卵泡液，卵泡液缓慢叠加在淋巴细胞分离液上（卵泡液与淋巴细胞分离液体积比为1：1），2000 r/min离心10min，取中间层颗粒细胞，用3～5mL TCMl99培养基混匀，2000 r/min离心l0min，弃上清，沉淀加入含体积分数10%小牛血清TCM 199lmL，用巴斯德管反复吹打10 min。台盼蓝染色后用细胞计数器行颗粒细胞计数（90%以上为活细胞），以40～80?L-1接种于48孔培养板中，每孔250?L，置37℃、體积分数5%CO2培养箱中培养，每48 h更换培养液。培养48、120 h，倒置显微镜下观察细胞形态。
1.3 PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP对人颗粒细胞E2合成的影响 以10?L睾酮（10-7 mol/L）作为底物，分5组培养。每组分别添加等同剂量的（10?g/L）细胞因子，A组为 PDGF-BB（Sigma， USA）和TGF-a（Sigma， USA）；B组添加PDGF-B和8-Br-cAMP（Sigma， USA）；PDGF-B和EGF（C组）；PDGF-B、EGF和TGF-a（D组）；PDGF-B、EGF、TGF-a和8-Br-cAMP，共孵育3 h，在与颗粒细胞共孵育后的0、48、120 h，收集上清液于Eppendorf管中， -20℃冻存待测。以不加任何细胞因子为空白对照。重复3孔。颗粒细胞孵育液E2含量采用考马斯亮蓝G250/BSA法测定，试剂盒由天津九鼎公司提供。吸去上清液后的培养孔，加入0.1mol/L NaOH 50?L， 消化贴壁细胞，收集于Eppendorf管中， -20℃冻存，待测蛋白质含量，以校正E2分泌量测定结果。
1.4 统计学处理 结果以均数±标准差（ ）或率（%）表示，采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学处理，均数组间比较用t 检验；率的差异性分析采用X2检验；组间比较采用方差分析，以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 颗粒细胞体外生存情况 黄素化颗粒细胞24h内贴壁。倒置显微镜下观察原代培养48、120h颗粒细胞，均呈椭圆形或星形生长，细胞间有延长的丝状突起相互连接，胞核大、圆，胞质富含颗粒及空泡。
2.2 PDGF-B、TGF-a、EGF和8-Br-cAMP 在与颗粒细胞共孵育的不同时间对E2分泌的影响 与空白对照比较，PCOS患者颗粒细胞经四种因子共同培养，A组在Oh和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；B组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05）；C组在0h和120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；D组在120h显著增加E2分泌量（P <0.05）；E组在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），见表1。 3 讨论
PCOS是不孕妇女排卵障碍的主要致病原因，发病机制不清楚。卵巢局部的生长因子在PCOS卵泡发育受阻、甾体激素分泌异常以及高胰岛素血症这一过程中扮演了重要的角色。PDGF-B家族由四个成员组成，包括 PDGF-B-A， -B， -C 和 -D，可以被PDGF-BR-α和PDGF-BR-β酪氨酸酶受体识别 ，PDGF-B在新血管形成、细胞外基质代谢、肺纤维化、肝硬化、胰腺纤维化等过程中具有重要作用[5-6]。
我们先前的研究结果表明，PCOS患者血清中PDGF-B含量和正常对照组比较没有统计学差异，而在卵泡液中的含量显著增高[4]。PCOS患者体外颗粒细胞培养发现，在高雄激素环境下，PDGF-B可以显著增加0h、48h和120h颗粒细胞E2的分泌[3]。有研究表明，雌激素可以通过PDGF介导的Akt通路，加重血管平滑肌脂肪瘤和淋巴血管平滑肌瘤的形成[7] ；雌激素受体的高表达与子宫内膜息肉的发生有关[8]。而PDGF-B和多囊肾的发生有关[9]，另外，PDGF-B在胰腺间质、纤维化区、炎症细胞浸润区表达增强[6]。本研究中卵泡液的PDGF-B与雌激素均升高，提示PDGF-B可能在多囊卵巢基质纤维化形成过程中具有重要作用。
TGF-a、EGF同是生长因子，均是强有力的有丝分裂原，可促进细胞的增殖与分化，产生多种生物学效应。研究证明，TGF-a和EGF在PCOS患者卵泡液的表达异常[2-3]。EGF显著抑制PCOS患者颗粒细胞分泌E2[3]。PCOS患者卵巢局部TGF-a、EGF活性增强，可能参与阻断芳香化酶的刺激和延缓卵泡凋亡，和其他细胞因子如胰岛素样因子系统相互作用，阻碍主导卵泡的出现和非主导卵泡的凋亡[10]。我们的研究结果表明，PDGF-B和TGF-a或EGF共孵育，可以显著增加颗粒细胞0h和120h E2分泌量（P <0.05），三者共培养，则只增加120h E2分泌量（P <0.05），说明TGF-a和EGF抑制E2分泌作用较短暂且迅速，PDGF-B作用时间持久，可能在阻碍主导卵泡的出现和非主导卵泡的凋亡中有重要作用。
8-Br-cAMP是第二信使类似物，可以直接通过扩散方式进入细胞内发挥作用。8-Br-cAMP在PCOS患者高雄激素环境下，可以显著增加0h、48h和120h颗粒细胞E2的分泌[2]。PDGF-B与8-Br-cAMP共孵育，在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），而0h没有显著影响。PDGF-B、TGF-a和EGF共孵育，增加120h E2分泌量（P <0.05）。将PDGF-B、TGF-a 、EGF和8-Br-cAMP共孵育，在48h和120h E2分泌量显著增加（P <0.05），而0h没有显著影响。说明PDGF-B与8-Br-cAMP在最初的共培养中对E2分泌有竞争抑制作用，可能通过某种共同的途径刺激E2分泌。
总之，PDGF-B刺激多囊卵巢综合征患者颗粒细胞E2分泌，与TGF-a 、EGF和8-Br-cAMP共孵育最终能促进颗粒细胞E2分泌，PDGF-B与雌激素的增高均与基质纤维化的形成有关，推测PDGF-B可能在刺激卵泡基质纤维化的形成过程中有重要作用。PDGF-B在多囊卵巢形成中的具体作用仍然不十分清楚，需要进一步的研究和探讨。
参考文献：
[1] March WA， Moore VM， Willson KJ， et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria[J]. Hum Reprod 2010， 25：544-551
[2] 贾丽婷， 张展， 王雪梅等. 8-Br-cAMP和血小板衍生生长因子对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞E2生成的影晌[J].郑州大学学报（医学版）.2006，41（2）：290-292.
[3] 王雪梅， 張展， 贾莉婷等. 血小板衍生生长因子和表皮生长因子对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞雌二醇生成的影响[J]. 郑州大学学报（医学版）. 2008，43（4）：645-648.
[4] 王雪梅， 张展， 贾莉婷. PDGF-B和EGF在多囊卵巢综合征中的表达[J]. 中国妇幼保健，2005，20（22）：2981-2982.
[5] Andrae J.， Gallini R.， Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J]. Genes Dev， 2008， 22， 1276-1312.
[6] 王东盛. PDGF及其受体在慢性胰腺炎胰腺纤维化机制中的作用及其对策的研究[学位论文].2006， 山东大学： 消化内科学
[7] Clements D， Asprey SL， McCulloch TA，et al.Analysis of the oestrogen response in an angiomyolipoma derived xenograft model[J]. Endocr Relat Cancer， 2009， 16（1）：59-72.
[8] 刘瑾. 雌孕激素受体及细胞色素芳香化酶在绝经前妇女子宫内膜息肉中的表达[学位论文]. 2010， 中山大学： 妇产科学.
[9] Nakamura T， Ebihara I， Nagaoka I， et al. Growth factor gene expression in kidney of murine polycystic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol. 1993 ， 3（7）：1378-1386.
[10] Homburg R.Involvement of growth factors in the pathophysiology of polycystic ovary syndrome[J]. Gynecol Endocrinol， 1998， 12（6）：391-397.