探讨烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)对大鼠缺氧心肌细胞自噬流的影响及机制。
方法取5只SD大鼠乳鼠，处死后取心脏，制备原代心肌细胞用于以下实验。(1)取原代心肌细胞，按随机数字表法分为常氧组、缺氧9 h组、缺氧9 h＋NAADP组，每组各5孔。常氧组细胞置于37 ℃恒温培养箱中常规培养9 h；缺氧9 h组和缺氧9 h＋NAADP组细胞置于缺氧培养箱(含体积分数94%氮气、体积分数5%二氧化碳及体积分数1%氧气)培养9 h，缺氧9 h＋NAADP组细胞缺氧处理前加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP。细胞计数试剂盒8检测细胞活力。(2)取原代心肌细胞，按随机数字表法分为常氧组、缺氧9 h组、缺氧9 h＋NAADP组、缺氧9 h＋trans－Ned－19组及缺氧9 h＋trans－Ned－19＋NAADP组，每组各2孔。常氧组细胞置于37 ℃恒温培养箱中常规培养9 h；余4组细胞同实验(1)行缺氧处理。缺氧处理前，缺氧9 h＋NAADP组细胞加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP，缺氧9 h＋ trans－Ned－19组细胞加入终物质的量浓度1 μmol/L trans－Ned－19，缺氧9 h＋trans－Ned－19＋NAADP组细胞加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP和1 μmol/L trans－Ned－19。蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ型和P62的表达量。(3)取原代心肌细胞，同实验(1)进行分组及处理。免疫荧光法检测溶酶体的酸碱度。对数据行单因素方差分析和LSD检验。
结果(1)常氧组细胞活力为1.114±0.024，明显高于缺氧9 h组的0.685±0.079，P<0.01。缺氧9 h＋NAADP组细胞活力为0.886±0.061，明显高于缺氧9 h组(P<0.05)。(2)与常氧组比较，缺氧9 h组细胞微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ型及P62表达量明显升高(P<0.01)。与缺氧9 h组比较，缺氧9 h＋NAADP组细胞P62表达量明显下降(P<0.01)，微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ型表达量无明显变化(P>0.05)；缺氧9 h＋trans－Ned－19组细胞微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ型及P62表达量均无明显变化(P>0.05)。与缺氧9 h＋NAADP组比较，缺氧9 h＋trans－Ned－19＋NAADP组细胞微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ型表达量无明显变化(P>0.05)，P62表达量明显升高(P<0.01)。(3)常氧组细胞绿色荧光强度大，与红色荧光共染好，溶酶体内环境酸性较强。缺氧9 h组细胞绿色荧光强度明显低于常氧组，溶酶体内环境酸性较常氧组减弱。缺氧9 h＋NAADP组细胞绿色荧光强度较缺氧9 h组明显增强，溶酶体内环境酸性较缺氧9 h组强，但仍低于常氧组。
结论NAADP通过酸化缺氧后心肌细胞溶酶体内环境，促进自噬体降解，减少自噬溶酶体堆积，修复受损自噬流从而改善心肌细胞活力。