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摘 要 通过单因素分析及响应面优化，研究超声处理对碱法制备蚕蛹蛋白得率的影响，得到了蚕蛹蛋白得率的数学模型，优化了制备条件，提高了碱法制备蚕蛹蛋白的得率。结果表明：NaOH浓度和液固比（V/m）对蚕蛹蛋白得率影响显著（p<0.05）。蚕蛹蛋白浸提的最佳工艺条件为：超声功率400 W，超声时间20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH浓度0.3%。在此工艺条件下，蚕蛹蛋白的得率为88.14%。制备的蚕蛹蛋白中的必需氨基酸含量符合FAO/WHO推荐标准，可以作为食品基料使用。
关键词 超声处理；蚕蛹蛋白质；蛋白得率；优化
中图分类号 S377 文献标识码 A
蚕丝业起源于中国，具有5 000多年的历史。我国的蚕丝业长期以来在国际上占据垄断地位，目前蚕茧和生丝产量占全球总产量的70%以上[1]。作为缫丝行业的副产物，蚕蛹因为含有的丰富营养活性成分使其被卫生部列为“食品新资源”中唯一的昆虫类食品[2]。蚕蛹干物质中蛋白含量可达到48.7%～52.5%[3]，蚕蛹蛋白中的必需氨基酸含量占总氨基酸含量的42%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.7[4]，完全符合WHO/FAO提出的蛋白参考模式。
常用的蛋白制备方法主要有：碱法、酶法、Tris-HCl法、盐法以及有机溶剂法，其中碱法和酶法在工业中应用较多。相比于酶法，碱法制备的效率高、能耗和成本较低，更适合于工业化生产。蚕蛹蛋白的制备多采用碱法和有机溶剂法制备，有机溶剂法制备蚕蛹蛋白容易造成溶剂的残留，陈芳艳等[5]则采用醇溶法制备蚕蛹蛋白，蛋白得率仅为8.47%，不能广泛应用。蚕蛹蛋白难溶于水，目前碱法制备蚕蛹蛋白的报道中，多采用高温长时间浸提或极大的液料比来获得较高的浸提率[6-8]。孙雁等[6]认为：高温长时间的浸提会使生成的蚕蛹蛋白蛹臭味浓，颜色较深，需要进一步采用有机溶剂或者臭氧脱色脱臭，而且造成蛋白的过度降解，对其加工特性（如起泡性，溶解性等）造成不同程度的影响；较大的料液比在一定程度上增加了生产造成的占地规模、能耗、废水处理等成本，不利于产品的工业化生产。因此，改进蚕蛹蛋白制备工艺的意义重大。
近年来，超声波作为一种物理的手段和工具，为科研工作者提供了一条能够把能量引入到分子中的高效途径和方法。超声波是频率大于20 kHz的声波，具有波动与能量的双重属性，能改变蛋白质分子结构，破坏蛋白质分子内键，对蛋白质溶解性有一定影响[9-10]。因此，超声的应用有助于提取过程中蛋白的溶出，从而提高蛋白的得率。超声协助碱法制备蛋白的方法已经在花生分离蛋白、芡实蛋白、松仁蛋白等方面展开，并取得显著的成效[11-13]。
本研究以缫丝蚕蛹为原料，通过单因素分析及响应面优化，研究了超声处理对碱法制备蚕蛹蛋白的影响，建立超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的数学模型，并优化制备条件，为蚕蛹蛋白的工业化生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂 缫丝后的蚕蛹由广东韶关翁源信达茧丝绸有限公司提供。原料的具体制备参照穆利霞等[14]的方法。
牛血清白蛋白由华美生物技术有限公司提供；Folin酚试剂由鼎国生物技术有限公司提供；氨基酸测定所用试剂为色谱纯；其它所用试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器 高速冷冻离心机（CR22G型，HITACHI，日本）；冷冻干燥机（ALPHA1-4/2-4型，德国）；精密pH计（320-S型，瑞士梅特勒-托利多仪器设备有限公司）；快速漩涡振荡仪（MM-2型，江苏省姜堰市沈高康建生化器具厂）；紫外/可见分光光度计（UV-2450，岛津，日本）；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司）；凯氏定氮仪（KDN-08，上海新嘉电子有限公司）；脂肪酸测定仪（SOX416型，GERHARDT，德国）；超声设备（JY92-IIN型，宁波新芝生物技术股份有限公司）；水分测定仪（MA型，赛多利斯，德国）；氨基酸分析仪（L-8900型，HITACHI，日本）。
1.2 方法
1.2.1 蚕蛹蛋白的碱法制备 将脱脂蚕蛹粉与一定浓度的浸提液按照一定液固比（V/m）充分混合均匀，在不同的超声条件下处理，得到的混合液过300目筛除去蛹皮等不溶物，得到的滤液为蛋白浸提液。以1 mol/L的HCl调节蛋白浸提液pH值为4.5，于4 ℃静置2 h，得到蛋白沉淀。沉淀在室温以4 000 r/min离心15 min分离。重新悬浮沉淀，并以2 mol/L NaOH调节pH值为7.0，4 ℃透析24 h脱盐（每4 h更换透析液）。脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥后得蚕蛹蛋白。
1.2.2 蚕蛹蛋白浸提条件的优化 以超声功率（W）（X1）、超声时间（min）（X2）、浸提的液固比（V/m）（X3） 和NaOH添加量（%）（X4）等四因素为自变量，以蚕蛹蛋白得率为响应值，设计了4因素3水平的中心组合试验[15]。试验各因素及其水平分别为：超声功率（300～500 W），超声时间（15～25 min），浸提液固比（V/m）（20 ∶ 1～60 ∶ 1），NaOH浓度（0.1%～0.5%）。将脱脂蚕蛹粉与试验浓度的浸提液按照试验体积比充分混合均匀，于试验的超声条件下处理。以考马斯亮蓝法测定过滤液中可溶性蛋白的含量[16]，并计算蛋白得率。计算公式如下：
蛋白得率=×100%
1.2.3 蚕蛹蛋白各指标的检测 脱脂蛹粉及蚕蛹蛋白的各指标按照如下方法测定：水份测定采用常压干燥法（GB/T14769-1993）；蛋白质含量采用凯氏定氮法（GB/T 14771-1993，Nx6.25）；脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T14772-1993）；灰分测定采用重量法（GB/T14770-1993）；总氨基酸组成采用Hitachi L-8900氨基酸分析仪进行测定，测定前用6 mol/L HCl于充氮管中充分酸水解（110 ℃，22 h）。 1.3 数据处理
数据采用SPSS统计分析软件进行相关性分析，p<0.05为统计学上有显著性差异；样本数n≥3。
2 结果与分析
2.1 单因素分析
2.1.1 超声功率对蛋白得率的影响 图1结果表明，当超声时间（10 min）和液固比（10 ∶ 1）恒定时，与对照相比，超声处理能够显著改善蚕蛹蛋白的得率。在超声功率为100 W时，得率比较低，在超声辅助提取的条件下，蛋白得率明显提高，当超声功率大于400 W， 继续增大超声功率时，得率逐渐降低。
超声功率是描述超声能量输入的一个重要指标，在介质相同的情况下，不同的功率会导致介质中不同的温度变化，从而影响蛋白的溶出率；同时适当的超声处理会改变蛋白的结构，从而改善蛋白的溶解性，增加蛋白的得率。而过高的功率会导致溶液的局部温度增加过快，使溶出的可溶性蛋白重新聚集沉淀，使蛋白的得率在一定程度上有所降低。
2.1.2 超声时间对蛋白得率的影响 图2结果表明，在超声功率（400 W）和液固比（10 ∶ 1）恒定的条件下，蚕蛹蛋白的得率随着超声时间的延长先升高后逐渐降低，这与超声本身对蛋白的影响有关。在提取时间为5～20 min之间，提取效率逐渐增加，5～10 min增幅最大，20 min之后，时间越长，反而不利于蛋白的提取。汤虎等[10]的研究结果表明，在适当的超声功率条件下，蛋白质的溶解性随着超声时间的延长出现先升高后降低的趋势，这是因为在超声波的作用下，蛋白质分子的结构变得疏松，蛋白质溶解性增加，随着处理时间的延长，蛋白质展开的肽链重新聚集，蛋白的溶解性降低。
2.1.3 液固比对蛋白得率的影响 当超声功率（400 W）和时间（20 min）恒定时，介质溶液的浓度直接会影响到超声的作用效果[17]。图3结果表明，在超声功率和超声时间恒定的条件下，随着溶液中脱脂蛹粉浓度的增加，超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的得率先增加后变化不明显。
提取时液固比过小时，蚕蛹中蛋白质不易从溶剂中被提出，故而蛋白的得率很低。提取液固比越大，蛋白质得率越大，这是由于蚕蛹蛋白多数为球蛋白，其蛋白溶解性低，因此增加溶剂的量能够增加蛋白的得率。但液料比过大时，如液固比>40时，得率增长缓慢，这可能是因为过低的反应底物浓度导致提取过程中蛋白损失的比重增加，从而使蛋白的得率改善不明显甚至略有降低。考虑到以上因素和工业生产的可行性，提取时液固比40 ∶ 1。超声介质中蛋白的浓度会影响超声波的作用效果，在适当的蛋白质浓度范围内，超声波的空化作用随着蛋白含量的增大而增大，蛋白质分子的结构变得疏松，导致蛋白的溶解性发生变化，蛋白得率增加；当蛋白含量增大时，在相等时间内，超声波空化作用减弱，过高的浓度导致相同时间内超声波对反应体系的作用减弱，从而影响其产生特殊的物理化学效应[18]。
2.1.4 NaOH添加量对蛋白得率的影响 当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）和液固比恒定（40 ∶ 1）时，适当提高溶液的pH值有利于增加蛋白的溶解性，因此NaOH浓度对蛋白的得率有一定的影响。图4结果表明，随着NaOH浓度的增加，蚕蛹蛋白的得率先增后减，当NaOH浓度在0.3%～0.5%之间时，蛋白得率达到最高。这是因为随着NaOH浓度增加，溶液中OH-的数量增加，蚕蛹蛋白的溶解性也增加，但过高的NaOH浓度会造成蚕蛹蛋白的部分降解，使得浸提液中可溶性蛋白含量降低。
2.1.5 NaCl添加量对蛋白得率的影响 图5结果表明，当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）、液固比恒定（40 ∶ 1）和NaOH浓度（0.3%）恒定时，随着NaCl浓度的增加，蚕蛹蛋白得率先增后减，但与对照相比，无明显增加趋势。浸提液中NaCl浓度的增加导致盐的含量增加，促进了蛋白质在溶液中的盐溶作用，过高的NaCl浓度会导致溶液中离子强度过高，蛋白质分子因带电荷而产生的斥力使其溶解度降低。但在本研究中，NaCl的添加对蛋白得率并无显著增加，因此，选择不添加NaCl进一步开展研究。
2.1.6 底料温度对蛋白得率的影响 由图6结果可以看出，当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）、液固比（40 ∶ 1）、NaOH浓度（0.3%）和NaCl添加量（0）恒定时，随着提取体系温度的升高，蚕蛹蛋白质的得率下降。这可能是因为底料温度高，超声过程中还有热量的释放，混合液温度再次升高，从而使蛋白的结构发生更加剧烈的变化，造成原来可溶的蛋白再度变性聚集。此外，温度过高，降温时间延长，该过程也容易引起微生物的滋生，所以综合考虑这些因素及节约能源消耗，底料温度应控制在常温（当时室温在16～20 ℃）。
2.2 响应面分析优化提取条件及试验结果
以影响显著的单因素指标超声功率（W）、超声时间（min）、浸提的液固比（V/m）和NaOH添加量（%）的最佳处理条件为中心点，建立超声协助蚕蛹蛋白浸提组合设计方案（表1），该条件在超声初始温度为常温、不添加NaCl的条件下进行。
由Design-Expert7.0统计软件的可知，蚕蛹蛋白制备的组合试验共有29个处理，试验结果列于表2。由数据可知，碱提法所得的蚕蛹蛋白得率在30.82%～87.03%之间。采用Design-Expert7.0统计软件对表2试验数据进行分析，建立响应面的回归模型，进而寻求最优响应值的因素水平。以蛋白得率为响应值，回归拟合后各因子对响应值的影响用以下方程表示：
蛋白得率/%=74.73-1.12X1+1.08X2+18.29X3+7.06X4-1.91X1X2-1.52X1X3-0.38X1X4+4.38X2X3-3.65X2X4-1.07X3X4-12.81X12-8.93X22-5.17X32-7.40X42
（式中X1、X2、X3、X4为各因素水平的代码）。 从表3可以看出，液料比和NaOH添加量对蛋白得率影响显著（p<0.05），超声功率和时间对蛋白得率影响不显著（p>0.05）。此外，各因素对蛋白得率的影响大小依次为：X3>X4>X1>X2。由表4可知：回归方程的R2=0.926 5，失拟项不显著（1.013 7>0.100 0），说明回归方程的拟合程度较好，模型是显著的。回归模型的F-检验显著，说明所拟合的二次回归方程合适，该模型的预测值和实际值比较接近。
对超声协助制备蚕蛹蛋白的蛋白得率的模型进行数学分析，优化的最佳处理条件为超声功率391 W、超声时间20.1 min、浸提的液固比（V/m）59.4 ∶ 1和NaOH添加量0.308%，所得到蛋白得率为87.97。考虑到可操作性，本研究选择超声功率400 W、超声时间20 min、浸提的液固比（V/m）60 ∶ 1和NaOH添加量0.3%等条件对上述模型进行验证，获得的蛋白得率为88.14%，验证结果与理论预测值接近。
2.3 蚕蛹蛋白的主要化学指标
利用优化工艺制备的蚕蛹蛋白的粗蛋白含量达92.30%，灰分含量4.19%，没有检测出粗脂肪，外观淡黄，无明显的蛹臭味，具有较好的感官色泽。
蛋白质的氨基组成和比例往往决定了它的性质和品质，本研究制备的蚕蛹蛋白的氨基酸含量及评分见表6，结果表明：蚕蛹蛋白的氨基酸评分均相对较高，接近甚至超过了FAO/WHO推荐标准[19]，因此可以作为食品基料来使用。
3 讨论与结论
超声波作为一种物理的手段和工具，有助于提取过程中蛋白的溶出，从而提高蚕蛹蛋白的得率。试验得到的超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的数学模型，碱法制备蚕蛹蛋白的浸提条件中，液固比（V/m）和NaOH浓度对蚕蛹蛋白的得率影响显著；通过响应面优化获得蚕蛹蛋白的最佳制备工艺条件为：超声功率400 W，超声时间20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH浓度0.3%。在此工艺条件下浸提，蛋白得率的实测值为88.14%，该得率显著高于醇提法的8.47%[5]和普通碱提法的78.69%[6]。本研究制备的蚕蛹蛋白氨基酸比例基本符合FAO/WHO推荐标准，可以作为食品基料使用，为蚕蛹蛋白的规模化开发奠定了基础。
参考文献
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责任编辑：沈德发
关键词 超声处理；蚕蛹蛋白质；蛋白得率；优化
中图分类号 S377 文献标识码 A
蚕丝业起源于中国，具有5 000多年的历史。我国的蚕丝业长期以来在国际上占据垄断地位，目前蚕茧和生丝产量占全球总产量的70%以上[1]。作为缫丝行业的副产物，蚕蛹因为含有的丰富营养活性成分使其被卫生部列为“食品新资源”中唯一的昆虫类食品[2]。蚕蛹干物质中蛋白含量可达到48.7%～52.5%[3]，蚕蛹蛋白中的必需氨基酸含量占总氨基酸含量的42%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.7[4]，完全符合WHO/FAO提出的蛋白参考模式。
常用的蛋白制备方法主要有：碱法、酶法、Tris-HCl法、盐法以及有机溶剂法，其中碱法和酶法在工业中应用较多。相比于酶法，碱法制备的效率高、能耗和成本较低，更适合于工业化生产。蚕蛹蛋白的制备多采用碱法和有机溶剂法制备，有机溶剂法制备蚕蛹蛋白容易造成溶剂的残留，陈芳艳等[5]则采用醇溶法制备蚕蛹蛋白，蛋白得率仅为8.47%，不能广泛应用。蚕蛹蛋白难溶于水，目前碱法制备蚕蛹蛋白的报道中，多采用高温长时间浸提或极大的液料比来获得较高的浸提率[6-8]。孙雁等[6]认为：高温长时间的浸提会使生成的蚕蛹蛋白蛹臭味浓，颜色较深，需要进一步采用有机溶剂或者臭氧脱色脱臭，而且造成蛋白的过度降解，对其加工特性（如起泡性，溶解性等）造成不同程度的影响；较大的料液比在一定程度上增加了生产造成的占地规模、能耗、废水处理等成本，不利于产品的工业化生产。因此，改进蚕蛹蛋白制备工艺的意义重大。
近年来，超声波作为一种物理的手段和工具，为科研工作者提供了一条能够把能量引入到分子中的高效途径和方法。超声波是频率大于20 kHz的声波，具有波动与能量的双重属性，能改变蛋白质分子结构，破坏蛋白质分子内键，对蛋白质溶解性有一定影响[9-10]。因此，超声的应用有助于提取过程中蛋白的溶出，从而提高蛋白的得率。超声协助碱法制备蛋白的方法已经在花生分离蛋白、芡实蛋白、松仁蛋白等方面展开，并取得显著的成效[11-13]。
本研究以缫丝蚕蛹为原料，通过单因素分析及响应面优化，研究了超声处理对碱法制备蚕蛹蛋白的影响，建立超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的数学模型，并优化制备条件，为蚕蛹蛋白的工业化生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂 缫丝后的蚕蛹由广东韶关翁源信达茧丝绸有限公司提供。原料的具体制备参照穆利霞等[14]的方法。
牛血清白蛋白由华美生物技术有限公司提供；Folin酚试剂由鼎国生物技术有限公司提供；氨基酸测定所用试剂为色谱纯；其它所用试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器 高速冷冻离心机（CR22G型，HITACHI，日本）；冷冻干燥机（ALPHA1-4/2-4型，德国）；精密pH计（320-S型，瑞士梅特勒-托利多仪器设备有限公司）；快速漩涡振荡仪（MM-2型，江苏省姜堰市沈高康建生化器具厂）；紫外/可见分光光度计（UV-2450，岛津，日本）；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司）；凯氏定氮仪（KDN-08，上海新嘉电子有限公司）；脂肪酸测定仪（SOX416型，GERHARDT，德国）；超声设备（JY92-IIN型，宁波新芝生物技术股份有限公司）；水分测定仪（MA型，赛多利斯，德国）；氨基酸分析仪（L-8900型，HITACHI，日本）。
1.2 方法
1.2.1 蚕蛹蛋白的碱法制备 将脱脂蚕蛹粉与一定浓度的浸提液按照一定液固比（V/m）充分混合均匀，在不同的超声条件下处理，得到的混合液过300目筛除去蛹皮等不溶物，得到的滤液为蛋白浸提液。以1 mol/L的HCl调节蛋白浸提液pH值为4.5，于4 ℃静置2 h，得到蛋白沉淀。沉淀在室温以4 000 r/min离心15 min分离。重新悬浮沉淀，并以2 mol/L NaOH调节pH值为7.0，4 ℃透析24 h脱盐（每4 h更换透析液）。脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥后得蚕蛹蛋白。
1.2.2 蚕蛹蛋白浸提条件的优化 以超声功率（W）（X1）、超声时间（min）（X2）、浸提的液固比（V/m）（X3） 和NaOH添加量（%）（X4）等四因素为自变量，以蚕蛹蛋白得率为响应值，设计了4因素3水平的中心组合试验[15]。试验各因素及其水平分别为：超声功率（300～500 W），超声时间（15～25 min），浸提液固比（V/m）（20 ∶ 1～60 ∶ 1），NaOH浓度（0.1%～0.5%）。将脱脂蚕蛹粉与试验浓度的浸提液按照试验体积比充分混合均匀，于试验的超声条件下处理。以考马斯亮蓝法测定过滤液中可溶性蛋白的含量[16]，并计算蛋白得率。计算公式如下：
蛋白得率=×100%
1.2.3 蚕蛹蛋白各指标的检测 脱脂蛹粉及蚕蛹蛋白的各指标按照如下方法测定：水份测定采用常压干燥法（GB/T14769-1993）；蛋白质含量采用凯氏定氮法（GB/T 14771-1993，Nx6.25）；脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T14772-1993）；灰分测定采用重量法（GB/T14770-1993）；总氨基酸组成采用Hitachi L-8900氨基酸分析仪进行测定，测定前用6 mol/L HCl于充氮管中充分酸水解（110 ℃，22 h）。 1.3 数据处理
数据采用SPSS统计分析软件进行相关性分析，p<0.05为统计学上有显著性差异；样本数n≥3。
2 结果与分析
2.1 单因素分析
2.1.1 超声功率对蛋白得率的影响 图1结果表明，当超声时间（10 min）和液固比（10 ∶ 1）恒定时，与对照相比，超声处理能够显著改善蚕蛹蛋白的得率。在超声功率为100 W时，得率比较低，在超声辅助提取的条件下，蛋白得率明显提高，当超声功率大于400 W， 继续增大超声功率时，得率逐渐降低。
超声功率是描述超声能量输入的一个重要指标，在介质相同的情况下，不同的功率会导致介质中不同的温度变化，从而影响蛋白的溶出率；同时适当的超声处理会改变蛋白的结构，从而改善蛋白的溶解性，增加蛋白的得率。而过高的功率会导致溶液的局部温度增加过快，使溶出的可溶性蛋白重新聚集沉淀，使蛋白的得率在一定程度上有所降低。
2.1.2 超声时间对蛋白得率的影响 图2结果表明，在超声功率（400 W）和液固比（10 ∶ 1）恒定的条件下，蚕蛹蛋白的得率随着超声时间的延长先升高后逐渐降低，这与超声本身对蛋白的影响有关。在提取时间为5～20 min之间，提取效率逐渐增加，5～10 min增幅最大，20 min之后，时间越长，反而不利于蛋白的提取。汤虎等[10]的研究结果表明，在适当的超声功率条件下，蛋白质的溶解性随着超声时间的延长出现先升高后降低的趋势，这是因为在超声波的作用下，蛋白质分子的结构变得疏松，蛋白质溶解性增加，随着处理时间的延长，蛋白质展开的肽链重新聚集，蛋白的溶解性降低。
2.1.3 液固比对蛋白得率的影响 当超声功率（400 W）和时间（20 min）恒定时，介质溶液的浓度直接会影响到超声的作用效果[17]。图3结果表明，在超声功率和超声时间恒定的条件下，随着溶液中脱脂蛹粉浓度的增加，超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的得率先增加后变化不明显。
提取时液固比过小时，蚕蛹中蛋白质不易从溶剂中被提出，故而蛋白的得率很低。提取液固比越大，蛋白质得率越大，这是由于蚕蛹蛋白多数为球蛋白，其蛋白溶解性低，因此增加溶剂的量能够增加蛋白的得率。但液料比过大时，如液固比>40时，得率增长缓慢，这可能是因为过低的反应底物浓度导致提取过程中蛋白损失的比重增加，从而使蛋白的得率改善不明显甚至略有降低。考虑到以上因素和工业生产的可行性，提取时液固比40 ∶ 1。超声介质中蛋白的浓度会影响超声波的作用效果，在适当的蛋白质浓度范围内，超声波的空化作用随着蛋白含量的增大而增大，蛋白质分子的结构变得疏松，导致蛋白的溶解性发生变化，蛋白得率增加；当蛋白含量增大时，在相等时间内，超声波空化作用减弱，过高的浓度导致相同时间内超声波对反应体系的作用减弱，从而影响其产生特殊的物理化学效应[18]。
2.1.4 NaOH添加量对蛋白得率的影响 当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）和液固比恒定（40 ∶ 1）时，适当提高溶液的pH值有利于增加蛋白的溶解性，因此NaOH浓度对蛋白的得率有一定的影响。图4结果表明，随着NaOH浓度的增加，蚕蛹蛋白的得率先增后减，当NaOH浓度在0.3%～0.5%之间时，蛋白得率达到最高。这是因为随着NaOH浓度增加，溶液中OH-的数量增加，蚕蛹蛋白的溶解性也增加，但过高的NaOH浓度会造成蚕蛹蛋白的部分降解，使得浸提液中可溶性蛋白含量降低。
2.1.5 NaCl添加量对蛋白得率的影响 图5结果表明，当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）、液固比恒定（40 ∶ 1）和NaOH浓度（0.3%）恒定时，随着NaCl浓度的增加，蚕蛹蛋白得率先增后减，但与对照相比，无明显增加趋势。浸提液中NaCl浓度的增加导致盐的含量增加，促进了蛋白质在溶液中的盐溶作用，过高的NaCl浓度会导致溶液中离子强度过高，蛋白质分子因带电荷而产生的斥力使其溶解度降低。但在本研究中，NaCl的添加对蛋白得率并无显著增加，因此，选择不添加NaCl进一步开展研究。
2.1.6 底料温度对蛋白得率的影响 由图6结果可以看出，当超声功率（400 W）、超声时间（20 min）、液固比（40 ∶ 1）、NaOH浓度（0.3%）和NaCl添加量（0）恒定时，随着提取体系温度的升高，蚕蛹蛋白质的得率下降。这可能是因为底料温度高，超声过程中还有热量的释放，混合液温度再次升高，从而使蛋白的结构发生更加剧烈的变化，造成原来可溶的蛋白再度变性聚集。此外，温度过高，降温时间延长，该过程也容易引起微生物的滋生，所以综合考虑这些因素及节约能源消耗，底料温度应控制在常温（当时室温在16～20 ℃）。
2.2 响应面分析优化提取条件及试验结果
以影响显著的单因素指标超声功率（W）、超声时间（min）、浸提的液固比（V/m）和NaOH添加量（%）的最佳处理条件为中心点，建立超声协助蚕蛹蛋白浸提组合设计方案（表1），该条件在超声初始温度为常温、不添加NaCl的条件下进行。
由Design-Expert7.0统计软件的可知，蚕蛹蛋白制备的组合试验共有29个处理，试验结果列于表2。由数据可知，碱提法所得的蚕蛹蛋白得率在30.82%～87.03%之间。采用Design-Expert7.0统计软件对表2试验数据进行分析，建立响应面的回归模型，进而寻求最优响应值的因素水平。以蛋白得率为响应值，回归拟合后各因子对响应值的影响用以下方程表示：
蛋白得率/%=74.73-1.12X1+1.08X2+18.29X3+7.06X4-1.91X1X2-1.52X1X3-0.38X1X4+4.38X2X3-3.65X2X4-1.07X3X4-12.81X12-8.93X22-5.17X32-7.40X42
（式中X1、X2、X3、X4为各因素水平的代码）。 从表3可以看出，液料比和NaOH添加量对蛋白得率影响显著（p<0.05），超声功率和时间对蛋白得率影响不显著（p>0.05）。此外，各因素对蛋白得率的影响大小依次为：X3>X4>X1>X2。由表4可知：回归方程的R2=0.926 5，失拟项不显著（1.013 7>0.100 0），说明回归方程的拟合程度较好，模型是显著的。回归模型的F-检验显著，说明所拟合的二次回归方程合适，该模型的预测值和实际值比较接近。
对超声协助制备蚕蛹蛋白的蛋白得率的模型进行数学分析，优化的最佳处理条件为超声功率391 W、超声时间20.1 min、浸提的液固比（V/m）59.4 ∶ 1和NaOH添加量0.308%，所得到蛋白得率为87.97。考虑到可操作性，本研究选择超声功率400 W、超声时间20 min、浸提的液固比（V/m）60 ∶ 1和NaOH添加量0.3%等条件对上述模型进行验证，获得的蛋白得率为88.14%，验证结果与理论预测值接近。
2.3 蚕蛹蛋白的主要化学指标
利用优化工艺制备的蚕蛹蛋白的粗蛋白含量达92.30%，灰分含量4.19%，没有检测出粗脂肪，外观淡黄，无明显的蛹臭味，具有较好的感官色泽。
蛋白质的氨基组成和比例往往决定了它的性质和品质，本研究制备的蚕蛹蛋白的氨基酸含量及评分见表6，结果表明：蚕蛹蛋白的氨基酸评分均相对较高，接近甚至超过了FAO/WHO推荐标准[19]，因此可以作为食品基料来使用。
3 讨论与结论
超声波作为一种物理的手段和工具，有助于提取过程中蛋白的溶出，从而提高蚕蛹蛋白的得率。试验得到的超声协助碱法制备蚕蛹蛋白的数学模型，碱法制备蚕蛹蛋白的浸提条件中，液固比（V/m）和NaOH浓度对蚕蛹蛋白的得率影响显著；通过响应面优化获得蚕蛹蛋白的最佳制备工艺条件为：超声功率400 W，超声时间20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH浓度0.3%。在此工艺条件下浸提，蛋白得率的实测值为88.14%，该得率显著高于醇提法的8.47%[5]和普通碱提法的78.69%[6]。本研究制备的蚕蛹蛋白氨基酸比例基本符合FAO/WHO推荐标准，可以作为食品基料使用，为蚕蛹蛋白的规模化开发奠定了基础。
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