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摘要：建立了高效液相色谱法同时测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法。样品用甲醇+水（70+30，V/V）超声提取，免疫亲和柱净化富集，光化学柱后衍生，高效液相色谱荧光法对芝麻酱中黄曲霉毒素含量进行测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。结果表明，样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限分别为0.5、0.2、0.7、0.2μg/kg，线性相关系数>0.999，三个添加水平的回收率均在87.2%～99.4%之间，相对标准偏差为2.88%～5.23%。
关键词：高效液相色谱；黄曲霉毒素；芝麻酱
中图分类号：TB
文献标识码：A
文章编号：16723198（2015）22022902
黄曲霉毒素是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，黄曲霉毒素主要有四种：B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，M1和M2是这种毒素的代谢产物。黄曲霉毒素是一种强致癌物质，能使人体的免疫功能丧失，诱导畸形、癌症的发生。许多国家已规定其相应的膳食摄入量和食品的限量标准。按照GB 2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》要求，在花生油、花生及其制品中黄曲霉毒素B1的允许最大含量水平为20μg/kg。目前市场上的芝麻酱，大都掺杂了很大比例的花生酱，由于花生容易发霉变质，将花生酱掺入芝麻酱中容易引起芝麻酱中黄曲霉毒素超标，因此开展芝麻酱中黄曲霉毒素的检测，对保障我国人民身体健康有重要意义。
目前，对黄曲霉毒素的测定方法主要有高效液相色谱法和酶联免疫吸附法。酶联免疫法操作简单，但特异性差；高效液相色谱法结合柱前衍生或普通的碘柱后衍生的方法，操作繁琐，分析时间长，并产生大量的有毒有害物质，不能满足批量检测的需求。
近年来用免疫亲和柱净化光化学柱后衍生-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素含量已有一些报道，但芝麻酱中黄曲霉毒素含量测定方法尚未见报道。本文通过免疫亲和柱净化，光化学柱后衍生，高效液相色谱法同时测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量，取得满意结果。
1材料与方法
1.1材料与仪器
甲醇（色谱纯）购自Sigma公司；黄曲霉毒素混合标准溶液B1、B2、G1、G2购自SUPLCO公司；3mL黄曲霉毒素免疫亲和柱购自中检维康公司。
Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪，配荧光检测器和光化学柱后衍生器；DIONEX Acclaim 120 （4.6×250mm，5μm）色谱柱；PRIMA PM3-900TL型超声波；美国Millipore公司超纯水处理器；Scientific industries vortex Genie 2涡旋振荡器；Agilent20管固相萃取SPE装置；奥特赛恩斯AP-9925无油真空泵。
1.2实验方法
1.2.1黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液的配制
（1）黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准储备液的配制。
准确移取1.0mL黄曲霉毒素混合标准溶液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
（2）黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准使用液的配制。
准确移取1.0mL黄曲霉毒素标准储备液于10mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度。
1.2.2色谱条件
色谱柱：C18（4.6×250mm，5μm），柱温：30℃，流动相为甲醇：水=45∶55（V∶V）；流速：1mL/min；进样量：10μL；激发波长：360nm；发射波长420nm。
1.2.3样品提取
称取均匀试样5g（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入1.0g氯化钠、25mL甲醇+水（V∶V，70∶30），涡旋混匀，超声提取20min，涡旋混匀，8000r/min离心10min，取上清液用折叠式槽纹滤纸过滤，收集滤液5mL，用10mL超纯水稀释，供净化用。
1.2.4样品净化
将免疫亲和柱连接于10mL注射器下，待免疫亲和柱内的液体弃去1/3后，将上述稀释后的滤液全部注入注射器中，样品溶液在重力下过柱，待样品提取液滴完后，向注射器内加入10mL水淋洗免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体，用真空泵抽干，向免疫亲和柱内准确加入1.0mL甲醇洗脱，用真空泵抽干，收集全部洗脱液，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱用。
2结果与讨论
2.1提取条件的选择
实验中采用甲醇-水（V∶V，6∶4）、甲醇-水（V∶V，7∶3）、甲醇-水（V∶V，8∶2）为提取剂，按照上述方法处理样品，加标量按质量浓度为10μg/kg添加，每个浓度的提取液平行测定三次，比较它们的提取效果。结果表明，甲醇-水（V∶V，6∶4）提取液，由于有机溶剂所占比例较低，提取效率较低；甲醇-水（V∶V，8∶2）提取液，甲醇浓度过高，破坏免疫亲和柱的抗体，回收率较低；甲醇-水（V∶V，7∶3）的提取效果较好，可以满足全部组分对回收率的要求（见表1）。
2.2衍生方式选择
对三氟乙酸柱前衍生法、柱后碘溶液衍生和光化学在线柱后衍生法进行了考察。三氟乙酸柱前衍生法受衍生试剂用量、衍生反应温度、衍生时间、溶剂转换等因素影响，衍生结果重现性较差，回收率在75.8%～115.5%之间，且需要用到大量有毒有害试剂；柱后碘衍生法和光化学柱后衍生法均能获得较好的重现性，回收率均在86.8%～99.5%之间，但柱后碘衍生法需要配制碘溶液，仪器操作繁琐；光化学衍生法在仪器操作上相对简单，样品处理后可直接进样分析，故本实验选择光化学在线柱后衍生法。经过光化学柱后衍生的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液色谱图见图1。 2.3线性范围及检出限
配制一系列质量浓度的黄曲霉毒素混合标准工作溶液，在优化的实验条件下分别进行测定，以峰面积Y（counts）对其浓度X（μg/L）进行线性回归；在阴性样品中依次加入较低浓度的标准溶液后进行测定，以3倍基线噪声（S/N=3）所对应的浓度计算方法的检出限，结果见表2。
2.4方法回收率和精密度实验
选择一个空白芝麻酱，分别加入低、中、高三种不同浓度的黄曲霉毒素，平行测定三次，回收率和相对标准偏差见表3。
2.5实际样品的测定
按照1.2实验方法对饮食店中随机采集的50份芝麻酱样品中黄曲霉毒素的含量进行分析，其中11份样品中检出黄曲霉毒素，总量分布在1～200μg/kg之间，色谱图见图2。
3结论
本方法建立的免疫亲和柱净化光化学柱后衍生-高效液相色谱法同时测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，方法操作简单、灵敏度高、重现性好，能够对芝麻酱样品中黄曲霉毒素含量进行批量、准确、快速的检测。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部.GB 27612011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].北京：中国标准出版社，2011.
[2]中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.232006食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定[S].北京：中国标准出版社，2007.
[3]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 189792003食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法[S].北京：中国标准出版社，2003.
[4]夏凡，杨丽君，王静等.电化学衍生高效液相色谱和荧光光度法检测花生酱中的黄曲霉毒素[J].分析实验室，2010，29（4）：119122.
[5]兰珊珊，刘宏程，梅文泉等.酶联免疫法测定不同食用植物油中黄曲霉毒素B1[J].粮食与油脂，2010，（4）：3941.
[6]柳洁，何碧英，孙俊红.ELISA和免疫亲和柱HPLC方法测定粮油食品中黄曲霉素B1[J].现代预防医学，2005，32（6）：653655.
[7]裴道国，刘冰，张立东.测定花生及花生制品中黄曲霉毒素：免疫亲和柱净化光化学在线衍生高效液相色谱荧光[J].中国国境卫生检疫杂志，2006，29（6）：368371.
关键词：高效液相色谱；黄曲霉毒素；芝麻酱
中图分类号：TB
文献标识码：A
文章编号：16723198（2015）22022902
黄曲霉毒素是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，黄曲霉毒素主要有四种：B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，M1和M2是这种毒素的代谢产物。黄曲霉毒素是一种强致癌物质，能使人体的免疫功能丧失，诱导畸形、癌症的发生。许多国家已规定其相应的膳食摄入量和食品的限量标准。按照GB 2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》要求，在花生油、花生及其制品中黄曲霉毒素B1的允许最大含量水平为20μg/kg。目前市场上的芝麻酱，大都掺杂了很大比例的花生酱，由于花生容易发霉变质，将花生酱掺入芝麻酱中容易引起芝麻酱中黄曲霉毒素超标，因此开展芝麻酱中黄曲霉毒素的检测，对保障我国人民身体健康有重要意义。
目前，对黄曲霉毒素的测定方法主要有高效液相色谱法和酶联免疫吸附法。酶联免疫法操作简单，但特异性差；高效液相色谱法结合柱前衍生或普通的碘柱后衍生的方法，操作繁琐，分析时间长，并产生大量的有毒有害物质，不能满足批量检测的需求。
近年来用免疫亲和柱净化光化学柱后衍生-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素含量已有一些报道，但芝麻酱中黄曲霉毒素含量测定方法尚未见报道。本文通过免疫亲和柱净化，光化学柱后衍生，高效液相色谱法同时测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量，取得满意结果。
1材料与方法
1.1材料与仪器
甲醇（色谱纯）购自Sigma公司；黄曲霉毒素混合标准溶液B1、B2、G1、G2购自SUPLCO公司；3mL黄曲霉毒素免疫亲和柱购自中检维康公司。
Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪，配荧光检测器和光化学柱后衍生器；DIONEX Acclaim 120 （4.6×250mm，5μm）色谱柱；PRIMA PM3-900TL型超声波；美国Millipore公司超纯水处理器；Scientific industries vortex Genie 2涡旋振荡器；Agilent20管固相萃取SPE装置；奥特赛恩斯AP-9925无油真空泵。
1.2实验方法
1.2.1黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液的配制
（1）黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准储备液的配制。
准确移取1.0mL黄曲霉毒素混合标准溶液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
（2）黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准使用液的配制。
准确移取1.0mL黄曲霉毒素标准储备液于10mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度。
1.2.2色谱条件
色谱柱：C18（4.6×250mm，5μm），柱温：30℃，流动相为甲醇：水=45∶55（V∶V）；流速：1mL/min；进样量：10μL；激发波长：360nm；发射波长420nm。
1.2.3样品提取
称取均匀试样5g（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入1.0g氯化钠、25mL甲醇+水（V∶V，70∶30），涡旋混匀，超声提取20min，涡旋混匀，8000r/min离心10min，取上清液用折叠式槽纹滤纸过滤，收集滤液5mL，用10mL超纯水稀释，供净化用。
1.2.4样品净化
将免疫亲和柱连接于10mL注射器下，待免疫亲和柱内的液体弃去1/3后，将上述稀释后的滤液全部注入注射器中，样品溶液在重力下过柱，待样品提取液滴完后，向注射器内加入10mL水淋洗免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体，用真空泵抽干，向免疫亲和柱内准确加入1.0mL甲醇洗脱，用真空泵抽干，收集全部洗脱液，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱用。
2结果与讨论
2.1提取条件的选择
实验中采用甲醇-水（V∶V，6∶4）、甲醇-水（V∶V，7∶3）、甲醇-水（V∶V，8∶2）为提取剂，按照上述方法处理样品，加标量按质量浓度为10μg/kg添加，每个浓度的提取液平行测定三次，比较它们的提取效果。结果表明，甲醇-水（V∶V，6∶4）提取液，由于有机溶剂所占比例较低，提取效率较低；甲醇-水（V∶V，8∶2）提取液，甲醇浓度过高，破坏免疫亲和柱的抗体，回收率较低；甲醇-水（V∶V，7∶3）的提取效果较好，可以满足全部组分对回收率的要求（见表1）。
2.2衍生方式选择
对三氟乙酸柱前衍生法、柱后碘溶液衍生和光化学在线柱后衍生法进行了考察。三氟乙酸柱前衍生法受衍生试剂用量、衍生反应温度、衍生时间、溶剂转换等因素影响，衍生结果重现性较差，回收率在75.8%～115.5%之间，且需要用到大量有毒有害试剂；柱后碘衍生法和光化学柱后衍生法均能获得较好的重现性，回收率均在86.8%～99.5%之间，但柱后碘衍生法需要配制碘溶液，仪器操作繁琐；光化学衍生法在仪器操作上相对简单，样品处理后可直接进样分析，故本实验选择光化学在线柱后衍生法。经过光化学柱后衍生的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液色谱图见图1。 2.3线性范围及检出限
配制一系列质量浓度的黄曲霉毒素混合标准工作溶液，在优化的实验条件下分别进行测定，以峰面积Y（counts）对其浓度X（μg/L）进行线性回归；在阴性样品中依次加入较低浓度的标准溶液后进行测定，以3倍基线噪声（S/N=3）所对应的浓度计算方法的检出限，结果见表2。
2.4方法回收率和精密度实验
选择一个空白芝麻酱，分别加入低、中、高三种不同浓度的黄曲霉毒素，平行测定三次，回收率和相对标准偏差见表3。
2.5实际样品的测定
按照1.2实验方法对饮食店中随机采集的50份芝麻酱样品中黄曲霉毒素的含量进行分析，其中11份样品中检出黄曲霉毒素，总量分布在1～200μg/kg之间，色谱图见图2。
3结论
本方法建立的免疫亲和柱净化光化学柱后衍生-高效液相色谱法同时测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，方法操作简单、灵敏度高、重现性好，能够对芝麻酱样品中黄曲霉毒素含量进行批量、准确、快速的检测。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部.GB 27612011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].北京：中国标准出版社，2011.
[2]中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.232006食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定[S].北京：中国标准出版社，2007.
[3]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 189792003食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法[S].北京：中国标准出版社，2003.
[4]夏凡，杨丽君，王静等.电化学衍生高效液相色谱和荧光光度法检测花生酱中的黄曲霉毒素[J].分析实验室，2010，29（4）：119122.
[5]兰珊珊，刘宏程，梅文泉等.酶联免疫法测定不同食用植物油中黄曲霉毒素B1[J].粮食与油脂，2010，（4）：3941.
[6]柳洁，何碧英，孙俊红.ELISA和免疫亲和柱HPLC方法测定粮油食品中黄曲霉素B1[J].现代预防医学，2005，32（6）：653655.
[7]裴道国，刘冰，张立东.测定花生及花生制品中黄曲霉毒素：免疫亲和柱净化光化学在线衍生高效液相色谱荧光[J].中国国境卫生检疫杂志，2006，29（6）：368371.