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资料和方法
动物和处理方法:10周大的雌鼠C57BL6,给予3周的时间以适应环境。单独养在一个可控环境温室中(温度22±3℃;湿度50±20%;12小时光暗交替,早上7点15开灯)。小鼠可以自由饮食。
试验动物重量20~24g,14只动物根据重量随机分成六组:第一组,性腺切除术(GDX)控制;第二到第六组,GDX+17β雌二醇(E2:0.05μg/小鼠)。研究的第1天,小鼠在麻醉下被切除卵巢(GDX)。在第8天作尸检之前,小鼠被单独皮下注射(0.2ml/小鼠)5%乙醇-0.4甲基纤维素(第一组)或者E2(第二组到第六组)。第一组在尸检前24小时注射。E2的注射分别在尸检1小时前(第二组),3小时前(第三组),6小时前(第四组),12小时前(第五组),24小时前(第六组)。
研究的第8天,小鼠在麻醉下从腹部大动脉放血,移除子宫颈。子宫被迅速冷冻在液氮中。组织保存在-80℃的环境中直到RNA被提取。根据对待方案,用低核苷酸微观排列分析法分析12 000组基因的临时mRNA变化(MG-U74 v2)。
RNA离析和微观排列杂交及分析:总的RNA根据制造商协议用Trizol法分离,总的RNA通过孵化400U上标ⅡRT,用一个 T7-oligo-d(T)24 primer 5'-GGCCAG-TGAATT-GTAATA-CGACTC- ACTATA -GGGAG-GCGG- (dT)24-3',1x 一级缓冲液(50 mM Tris·HCl,pH8.3,75mM KCl,3mM MgCl2,10mM DTT),和 0.5mM dNTPs 在42℃运转一个小时转换为cDNA。二级合成是通过40U的DNA聚化酶Ⅰ,埃希氏菌属大肠杆菌DNA链接酶,2U核糖核酸酶H,1x反作用缓冲液[18.8mM Tris·HCl,pH8.3,90.6mM KCl,4.6mM MgCl2,3.8mM DTT,0.15mM NAD,10mM(NH4)2SO4],和0.2mM dNTPs在16℃运作2小时。
聚类分析:基因在一个以上的生物过程中进行分类,因为许多蛋白质能反映许多不同的细胞新陈代谢中的生理活动,而这些生理活动更能说明基因机能的代表性。
Q-RT-PCR:复制样本中的总的RNA中相当于20ng的cDNA,在活的有机体内通过光循环实时PCR设备,被用来进行荧光基础实时PCR量化。
结果
微观排列分析:子宫到雌二醇的通常反应。被E2上调的736组基因中,有4种基因表达:基因簇A(19%,139/736)3小时内起反应,基因簇B(37%,274/736)6小时内,基因簇C(26%,188/736)12小时内,基因簇D(18%,135/736)24小时内。下调基因的表现中(基因簇E,F,G),能量代谢是基因簇E下调中的主要生物过程,基因簇F,与基因簇E相比,在信号转换,转移和蛋白质代谢中的基因扩增的表现为细微的减少。
特定前期基因调整:0~6小时(基因簇A,B,E)。基因相关的信号转换主要观测基因簇A,特别是那些属于蛋白激酶层叠,MAPKK层叠,mRNA分解代谢,分别证明了层叠扩大数3.6,5.7和11.1。
特定后期基因调整:6~24小时(基因簇C,D,F和G):蛋白新陈代谢中的传输分子和基因占了基因簇C中的大部分,特别是基因相关的细胞内传输(3.6-褶皱),细胞定位(3.5-褶皱),蛋白质确定对象(5.5-褶皱),肌动球蛋白组织结构和生物源(29.9-褶皱)。在基因簇D中,与细胞粘附、发展,和能量代谢相关的基因过度表达。
雌二醇调节IGF-I路径:为了确认IGF-I路径中一些基因的基因表现的临时改变,执行Q-RT-PCR。简要地说,分析了六组IGF相关基因,三组Ras/Raf/MAPK路径相关基因,三组PIK3路径相关基因,五组酪氨酸和MAP激酶磷酸酯基因。所有基因测试在微观排列和Q-RT-PCR之间显示了82%的相关率。
IGF相关基因:当今研究中,IGF-I基因在12小时内起反应。有趣的是,它的感受体,IGF-IR,在6小时内下调。IGFBP2和-6的表现在12小时内分别是增加和减少。
Ras/Raf/MAPK路径:Cdc25c基因表现在6到24小时内明显增加。
PI3K路径:GAB1和 PIK3R2的基因表达在6小时内减少。编码为恩多菲林细胞死亡促进者的SH3领域GRB2样B1基因(SH3GLB1),首先在3小时内细微上调,然后在6~12小时之间反应缓慢。BCL2样11基因也在12小时内下调。PIK3路径的IGF-I活化促进了反减弱影响。
酪氨酸和MAP激酶磷酸酯:PTP基因PTP1B和PTP4A在3小时内被E2早期引起反应。类似的,MAP激酶磷酸酯基因MKP1和MKP3在3小时内被上调。总的来说,这些观测提出,通过瞄准IGF-I路径,PTPs和MKPs可能潜在包含在小鼠的E2子宫营养影响的范围和时期。
讨论
E2激活的转换层叠导致小鼠的子宫营养影响。为了控制这个过程,E2引起普通(基因调制)和非普通机制,虽然这次研究中观测的变化都是普通的,但是它们是从不同的基因表达中得来的。虽然基因转换变化是不同信号通道的主要诱因,但是我们不能排斥其他非普通机制,特别是包含在转换信号中的、可能引起蛋白质水平变化的重要因素。关于机制的全面认识,对于子宫癌和其他妇科疾病非常重要。IGF-I 路径是过程的关键,因此关于这方面的研究须进一步进行。
动物和处理方法:10周大的雌鼠C57BL6,给予3周的时间以适应环境。单独养在一个可控环境温室中(温度22±3℃;湿度50±20%;12小时光暗交替,早上7点15开灯)。小鼠可以自由饮食。
试验动物重量20~24g,14只动物根据重量随机分成六组:第一组,性腺切除术(GDX)控制;第二到第六组,GDX+17β雌二醇(E2:0.05μg/小鼠)。研究的第1天,小鼠在麻醉下被切除卵巢(GDX)。在第8天作尸检之前,小鼠被单独皮下注射(0.2ml/小鼠)5%乙醇-0.4甲基纤维素(第一组)或者E2(第二组到第六组)。第一组在尸检前24小时注射。E2的注射分别在尸检1小时前(第二组),3小时前(第三组),6小时前(第四组),12小时前(第五组),24小时前(第六组)。
研究的第8天,小鼠在麻醉下从腹部大动脉放血,移除子宫颈。子宫被迅速冷冻在液氮中。组织保存在-80℃的环境中直到RNA被提取。根据对待方案,用低核苷酸微观排列分析法分析12 000组基因的临时mRNA变化(MG-U74 v2)。
RNA离析和微观排列杂交及分析:总的RNA根据制造商协议用Trizol法分离,总的RNA通过孵化400U上标ⅡRT,用一个 T7-oligo-d(T)24 primer 5'-GGCCAG-TGAATT-GTAATA-CGACTC- ACTATA -GGGAG-GCGG- (dT)24-3',1x 一级缓冲液(50 mM Tris·HCl,pH8.3,75mM KCl,3mM MgCl2,10mM DTT),和 0.5mM dNTPs 在42℃运转一个小时转换为cDNA。二级合成是通过40U的DNA聚化酶Ⅰ,埃希氏菌属大肠杆菌DNA链接酶,2U核糖核酸酶H,1x反作用缓冲液[18.8mM Tris·HCl,pH8.3,90.6mM KCl,4.6mM MgCl2,3.8mM DTT,0.15mM NAD,10mM(NH4)2SO4],和0.2mM dNTPs在16℃运作2小时。
聚类分析:基因在一个以上的生物过程中进行分类,因为许多蛋白质能反映许多不同的细胞新陈代谢中的生理活动,而这些生理活动更能说明基因机能的代表性。
Q-RT-PCR:复制样本中的总的RNA中相当于20ng的cDNA,在活的有机体内通过光循环实时PCR设备,被用来进行荧光基础实时PCR量化。
结果
微观排列分析:子宫到雌二醇的通常反应。被E2上调的736组基因中,有4种基因表达:基因簇A(19%,139/736)3小时内起反应,基因簇B(37%,274/736)6小时内,基因簇C(26%,188/736)12小时内,基因簇D(18%,135/736)24小时内。下调基因的表现中(基因簇E,F,G),能量代谢是基因簇E下调中的主要生物过程,基因簇F,与基因簇E相比,在信号转换,转移和蛋白质代谢中的基因扩增的表现为细微的减少。
特定前期基因调整:0~6小时(基因簇A,B,E)。基因相关的信号转换主要观测基因簇A,特别是那些属于蛋白激酶层叠,MAPKK层叠,mRNA分解代谢,分别证明了层叠扩大数3.6,5.7和11.1。
特定后期基因调整:6~24小时(基因簇C,D,F和G):蛋白新陈代谢中的传输分子和基因占了基因簇C中的大部分,特别是基因相关的细胞内传输(3.6-褶皱),细胞定位(3.5-褶皱),蛋白质确定对象(5.5-褶皱),肌动球蛋白组织结构和生物源(29.9-褶皱)。在基因簇D中,与细胞粘附、发展,和能量代谢相关的基因过度表达。
雌二醇调节IGF-I路径:为了确认IGF-I路径中一些基因的基因表现的临时改变,执行Q-RT-PCR。简要地说,分析了六组IGF相关基因,三组Ras/Raf/MAPK路径相关基因,三组PIK3路径相关基因,五组酪氨酸和MAP激酶磷酸酯基因。所有基因测试在微观排列和Q-RT-PCR之间显示了82%的相关率。
IGF相关基因:当今研究中,IGF-I基因在12小时内起反应。有趣的是,它的感受体,IGF-IR,在6小时内下调。IGFBP2和-6的表现在12小时内分别是增加和减少。
Ras/Raf/MAPK路径:Cdc25c基因表现在6到24小时内明显增加。
PI3K路径:GAB1和 PIK3R2的基因表达在6小时内减少。编码为恩多菲林细胞死亡促进者的SH3领域GRB2样B1基因(SH3GLB1),首先在3小时内细微上调,然后在6~12小时之间反应缓慢。BCL2样11基因也在12小时内下调。PIK3路径的IGF-I活化促进了反减弱影响。
酪氨酸和MAP激酶磷酸酯:PTP基因PTP1B和PTP4A在3小时内被E2早期引起反应。类似的,MAP激酶磷酸酯基因MKP1和MKP3在3小时内被上调。总的来说,这些观测提出,通过瞄准IGF-I路径,PTPs和MKPs可能潜在包含在小鼠的E2子宫营养影响的范围和时期。
讨论
E2激活的转换层叠导致小鼠的子宫营养影响。为了控制这个过程,E2引起普通(基因调制)和非普通机制,虽然这次研究中观测的变化都是普通的,但是它们是从不同的基因表达中得来的。虽然基因转换变化是不同信号通道的主要诱因,但是我们不能排斥其他非普通机制,特别是包含在转换信号中的、可能引起蛋白质水平变化的重要因素。关于机制的全面认识,对于子宫癌和其他妇科疾病非常重要。IGF-I 路径是过程的关键,因此关于这方面的研究须进一步进行。