【摘 要】
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目的 构建Flag-葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A,SPA）与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5，在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白，并检测其转座酶活性。方法 合成Flag-pA基因的DNA编码序列，PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5，构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5；转化大
【机 构】
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三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81372833）； 湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目（Q20191901）； 2018年安琪营养科研基金项目（AF2018002）；
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目的 构建Flag-葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A,SPA）与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5，在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白，并检测其转座酶活性。方法 合成Flag-pA基因的DNA编码序列，PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5，构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5；转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达带有Flag标签的pA-Tn5蛋白，并经几丁质树脂亲和纯化后透析复性；将Flag-p A-Tn5蛋白与含测序引物接头的转座子DNA片段组装成转座体，取不同稀释比例的转座体与人外周血白细胞基因组DNA共孵育，以DNA孵育产物为模板、测序引物进行PCR扩增，鉴定Flag-pA-Tn5转座酶活性。结果 重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5经双酶切和测序证明构建正确；表达的重组蛋白产量为211.1μg/mL，能够被几丁质树脂亲和纯化，纯度为84%;Flag-pA-Tn5蛋白与转座子DNA片段组装后，能有效切割人外周血白细胞基因组DNA，并连接测序引物接头，具有转座酶活性。结论 获得了具有转座酶活性的重组Flag-pA-Tn5蛋白，为进一步利用Flag-p A-Tn5转座酶进行基因功能组学研究奠定了基础。
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