【摘 要】
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目的:构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)慢病毒载体,感染神经干细胞,使其能够过表达目的基因.方法:依据GenBank数据库中基因信息设计GDNF基因引物,聚合酶链反应(PCR)扩增GDNF基因片段.运用基因重组技术、质粒载体双酶切反应及重组产物转化将GDNF基因克隆至pLVX-mCMV-ZsGreen载体,经酶切、测序鉴定重组质粒.将成功构建的质粒转染293T和HEK293细胞,慢病毒包装并测定滴度.最后将包装好的病毒感染神经干细胞,进行Q-PCR检测.结果:(1)经酶切和测序鉴定,成功建立了pLV
【机 构】
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陕西中医药大学附属医院脊柱病区,陕西咸阳712000
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目的:构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)慢病毒载体,感染神经干细胞,使其能够过表达目的基因.方法:依据GenBank数据库中基因信息设计GDNF基因引物,聚合酶链反应(PCR)扩增GDNF基因片段.运用基因重组技术、质粒载体双酶切反应及重组产物转化将GDNF基因克隆至pLVX-mCMV-ZsGreen载体,经酶切、测序鉴定重组质粒.将成功构建的质粒转染293T和HEK293细胞,慢病毒包装并测定滴度.最后将包装好的病毒感染神经干细胞,进行Q-PCR检测.结果:(1)经酶切和测序鉴定,成功建立了pLVX-rGDNF-mCMV-ZsGreen的基因重组慢病毒载体;(2)包装的病毒感染293T及HEK293细胞细胞后,可见大量的阳性蛋白表达(绿色荧光蛋白);(3)包装好的慢病毒感染神经干细胞后,能够大量表达GDNF基因.结论:成功构建含有GDNF基因的慢病毒,且具有较强感染能力.神经干细胞经包装慢病毒感染后,能够大量表达GDNF基因.本研究为基因修饰神经干细胞治疗脊髓损伤提供了实验基础.
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