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摘要
采用1/2MS培养基，以蝴蝶兰果荚为外植体进行快速繁殖的研究。对蝴蝶兰快速繁殖各阶段的条件进行了优化，结果表明，最佳外植体为果荚，培养基的最适pH为5.8;各阶段最佳培养基浓度，诱导原球为1/2MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA，原球茎增殖为1/2MS+3.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L NAA，诱导原球茎分化为1/2MS+1.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L NAA，诱导生根为1/2MS+ 0.6 mg/L IBA。此外，培养基中还需加入10%的香蕉泥上清液、蔗糖2%、琼脂0.8%、活性炭2.0 g/L效果最好。
关键词 蝴蝶兰;丛生芽;组织培养
中图分类号 S682.31 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）34-12059-02
蝴蝶兰是国际上最具有商业价值的四大观赏热带兰之一。但其种子无胚乳，自然条件下很难萌发，用常规的无性繁殖，增殖速度慢，难以满足市场的需求，因此研究蝴蝶兰的快速繁殖途径具有重要意义。用组培方法直接采用无菌幼苗诱导原球茎，具有取材方便、操作简单、繁殖系数高等优点，能在短时间内大量培育蝴蝶兰。笔者分别以蝴蝶兰的果荚、茎尖、叶片3种外植体为组织培养材料，采用1/2MS培养基，其配制时将MS培养基的大量元素减半，其他组成不变[1]，对蝴蝶兰丛生芽组织培养进行了研究。
1 材料与方法
1.1 原球茎的诱导增殖与继代培养 将原球茎在未分化时切开进行继代培养。原球茎不宜切得过小，2～3个为宜，一般30 d左右须转接1次，这样既可以扩大繁殖系数，也可以有效地抑制培养基褐化。在1/2MS培养基中添加1.0、1.5、2.0、2.0、3.0 mg/L 6BA和0.2、0.2、0.4、0.2、0.2 mg/L NAA，组成5个处理，比较增殖结果，确定最佳的激素浓度。
1.2 原球茎的分化
将原球茎接种到分化培养基上，可进一步诱导其分化，长出幼芽，设计0.5、0.5、1.0、1.0、1.5 mg/L 6BA和0、0.5、0.2、0.5、0.2 mg/L的NAA组合，比较原球茎的分化情况，得出最佳激素浓度配比[2]。
1.3 诱导生根 将具有2～3片小叶的大芽接入生根培养基中，进行生根诱导，分化形成完整的植株。分别设定0.2、 0.5 、1.0 mg/L IBA和0.2、 0.5及 1.0 mg/L NAA处理，研究其对生根的影响。培养28 d后观察并计算生根率[3]。
1.4 炼苗与移栽
当蝴蝶兰幼苗长至3～4片叶、4～5条根，且形体健壮时，打开封口膜在室温下炼苗7 d，栽培介质宜选水苔，其提前消毒浸泡4 h[2]。移栽时将小苗轻轻夹出培养瓶，洗净根部培养基，用0.1%的高锰酸钾水溶液浸泡5 min，自然晾干后移栽。注意控制栽培环境，温度保持在25～29 ℃，相对湿度保持在80%，低光照。14 d后，逐步提高光照强度。30 d后转入常规栽培管理，成苗率可在85%以上。
2 结果与分析
2.1 原球茎的诱导
2.1.1 激素浓度对原球茎诱导的影响。
以果荚的种胚为外植体进行原球茎诱导，采用1/2MS培养基，6BA和NAA的浓度见表1[4]。
由表1可知，NAA对原球茎诱导的影响不大，而6BA的影响显著。随着6BA浓度的增加，原球茎增殖数量增多，颗粒也饱满，当6BA 2.0 mg/L、NAA0.5 mg/L时，原球茎形态最佳。而当6BA超过2.0 mg/L时，增殖量虽然增加，但颗粒变小，颜色也开始由绿变黄。研究认为，低浓度6BA更有利于原球茎的增殖。NAA对原球茎增殖分化影响不明显。低浓度的NAA对原球茎增殖有促进作用，高浓度的则不利[5]。所以原球茎诱导的最佳激素浓度为6BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L。
表1 各激素组合诱导原球茎的结果比较
编号 6BA
mg/L NAA
mg/L原球茎的形态
①0.50.2 颗粒小，数量少，颜色发黄
②0.51.0颗粒小，数量少，颜色微黄
③1.00.2颗粒中等，数量少，颜色微黄
④1.01.0颗粒中等，数量少，颜色微绿
⑤2.00.2质量中等，数量多，颜色鲜绿
⑥2.00.5颗粒大，数量多，颜色翠绿
⑦3.00.2颗粒小，数量多，顏色微绿
⑧3.00.5颗粒小，数量多，颜色微黄
2.1.2
蔗糖浓度对原球茎诱导的影响。
蔗糖作为培养基中的碳源，既为培养基提供能源物质又起到调节渗透压的作用。试验中蔗糖浓度分别为1.0%、2.0%、3.0%，新增原球茎的个数分别为54、80、35，原球茎形态分别为颗粒中等，颜色微绿;颗粒大，颜色鲜绿;颗粒中等，颜色微黄。可见添加1.0%和2.0%蔗糖时，新增原球茎数为54、80个，且原球茎呈绿色、颗粒状。当蔗糖浓度增加到3.0%时，此时培养基渗透压较高，前期不利于原球茎的诱导。故最佳的蔗糖浓度应为2.0%。
2.2 原球茎的增殖
选取1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L的6BA和0.2 mg/L的NAA组合（分别为1、2、3、4号培养基），原球茎的增殖快慢比较结果：1.5～2.0 mg/L的6BA有利于原球茎的增殖，繁殖速度较快，增殖数量较多，2.0 mg/L时效果最佳;浓度超过2.0 mg/L时，不利于其增殖，繁殖速度慢。NAA对原球茎的增殖作用不明显，但低浓度的NAA有协同作用[6]。所以最佳原球茎增殖培养基为 1/2MS+ 6BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。 不同激素浓度的4种培养基对原球茎增殖的影响见图1。 注：a.1号培养基;b.2号培养基;c.3号培养基;d.4号培养基
图1 不同激素浓度对原球茎增殖的影响
2.3 原球茎的分化增殖
原球茎的分化及增殖所需6BA和NAA的浓度相对较原球茎诱导及增殖的浓度要低，且两者的比值也小。6BA与NAA的浓度组合及分化结果见表2。
由表2可知，原球茎的增殖与分化主要取决于6BA浓度的大小。低浓度的6BA有利于分化，6BA浓度超过2.0 mg/L时，不促进增殖。NAA的作用亦不显著，但不加入NAA时，原球茎也难以分化出芽。所以最佳原球茎分化激素浓度为6BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L。不同激素浓度处理对原球茎分化结果见图2。
表2 不同激素浓度对原球茎分化的影响
编号6BA∥mg/L NAA∥mg/L观察结果
①0.50极少数分化
②0.50.5少数分化
③1.00.2完全分化
④1.00.5多数分化
⑤1.50.2部分增殖
⑥2.00.5多数增殖
图2 不同激素浓度对原球茎分化的影响
2.4 誘导生根
2.4.1 不同激素对诱导生根的影响。选用IBA和NAA 2种激素进行诱导生根，培养基组成及生根情况见表3。
由表3可知，IBA和NAA均能诱导生根，但两者相比，IBA诱导生根的效果比NAA更好，生根率高达90%。所以最佳诱导生根的培养基为1/2MS外加激素IBA。
表3 诱导生根的结果比较
编号基本培养基IBA
mg/L生根率
%平均根数
条
①1/2MSIBA 0.2502～3
②1/2MSIBA 0.5904～5
③1/2MSIBA 1.0843～4
④1/2MSNAA 0.2402～3
⑤1/2MSNAA 0.5633～4
⑥1/2MSNAA 1.0582～3
2.4.2
不同浓度的IBA对诱导生根率的影响。由表4可知，幼苗开始生根天数随IBA浓度的增加而缩短，IBA浓度为0.4～0.6 mg/L时，随IBA浓度的增加，组培苗的生根率、每株根数增加。当IBA浓度超过0.6 mg/L时生根率开始下降。综合比较，以IBA 0.6 mg/L组培幼苗的生根效果最好，为28 d左右，根数平均有4～5条，根长达3.5 cm，小苗生长发育正常。
2.5 炼苗与移栽
蝴蝶兰对温度要求比较严格，最适栽培温度为白天25～28 ℃，夜间18～10 ℃，蝴蝶兰不适于强烈阳光下生长，夏天要用遮阳网遮蔽阳光;基质选用水苔作基质的盆栽法，主要适用多孔塑料盆，盆高最好小于直径，盆下部用小块泡沫填充以利排水，上面用水苔填充，将小苗栽植于盆中，切不可压得太紧，以防烂根;蝴蝶兰在温度适宜条件下生长迅速，因此，其需肥量比其他兰花稍多，主要以液肥为主，春天适当多施，夏秋少施。
表4 不同浓度IBA的诱导生根的比较
IBA
mg/L生根率
%平均根
数∥条根长
cm开始生根
天数∥d
0.2581/24.236
0.4862/33.933
0.6984/53.528
0.8894/52.825
1.0843/41.721
3 结论与讨论
研究表明，诱导原球茎的最佳外植体为果荚，且果荚生长期为4个月最好;采用1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖2.0%、琼脂0.8%、有机添加物为10%香蕉泥的上清液最佳;添加活性炭2.0 g/L防止褐化效果最好。蝴蝶兰组织
培养添加激素为6BA、NAA和IBA，各阶段最佳激素及浓度
采用1/2MS培养基，以蝴蝶兰果荚为外植体进行快速繁殖的研究。对蝴蝶兰快速繁殖各阶段的条件进行了优化，结果表明，最佳外植体为果荚，培养基的最适pH为5.8;各阶段最佳培养基浓度，诱导原球为1/2MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA，原球茎增殖为1/2MS+3.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L NAA，诱导原球茎分化为1/2MS+1.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L NAA，诱导生根为1/2MS+ 0.6 mg/L IBA。此外，培养基中还需加入10%的香蕉泥上清液、蔗糖2%、琼脂0.8%、活性炭2.0 g/L效果最好。
关键词 蝴蝶兰;丛生芽;组织培养
中图分类号 S682.31 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）34-12059-02
蝴蝶兰是国际上最具有商业价值的四大观赏热带兰之一。但其种子无胚乳，自然条件下很难萌发，用常规的无性繁殖，增殖速度慢，难以满足市场的需求，因此研究蝴蝶兰的快速繁殖途径具有重要意义。用组培方法直接采用无菌幼苗诱导原球茎，具有取材方便、操作简单、繁殖系数高等优点，能在短时间内大量培育蝴蝶兰。笔者分别以蝴蝶兰的果荚、茎尖、叶片3种外植体为组织培养材料，采用1/2MS培养基，其配制时将MS培养基的大量元素减半，其他组成不变[1]，对蝴蝶兰丛生芽组织培养进行了研究。
1 材料与方法
1.1 原球茎的诱导增殖与继代培养 将原球茎在未分化时切开进行继代培养。原球茎不宜切得过小，2～3个为宜，一般30 d左右须转接1次，这样既可以扩大繁殖系数，也可以有效地抑制培养基褐化。在1/2MS培养基中添加1.0、1.5、2.0、2.0、3.0 mg/L 6BA和0.2、0.2、0.4、0.2、0.2 mg/L NAA，组成5个处理，比较增殖结果，确定最佳的激素浓度。
1.2 原球茎的分化
将原球茎接种到分化培养基上，可进一步诱导其分化，长出幼芽，设计0.5、0.5、1.0、1.0、1.5 mg/L 6BA和0、0.5、0.2、0.5、0.2 mg/L的NAA组合，比较原球茎的分化情况，得出最佳激素浓度配比[2]。
1.3 诱导生根 将具有2～3片小叶的大芽接入生根培养基中，进行生根诱导，分化形成完整的植株。分别设定0.2、 0.5 、1.0 mg/L IBA和0.2、 0.5及 1.0 mg/L NAA处理，研究其对生根的影响。培养28 d后观察并计算生根率[3]。
1.4 炼苗与移栽
当蝴蝶兰幼苗长至3～4片叶、4～5条根，且形体健壮时，打开封口膜在室温下炼苗7 d，栽培介质宜选水苔，其提前消毒浸泡4 h[2]。移栽时将小苗轻轻夹出培养瓶，洗净根部培养基，用0.1%的高锰酸钾水溶液浸泡5 min，自然晾干后移栽。注意控制栽培环境，温度保持在25～29 ℃，相对湿度保持在80%，低光照。14 d后，逐步提高光照强度。30 d后转入常规栽培管理，成苗率可在85%以上。
2 结果与分析
2.1 原球茎的诱导
2.1.1 激素浓度对原球茎诱导的影响。
以果荚的种胚为外植体进行原球茎诱导，采用1/2MS培养基，6BA和NAA的浓度见表1[4]。
由表1可知，NAA对原球茎诱导的影响不大，而6BA的影响显著。随着6BA浓度的增加，原球茎增殖数量增多，颗粒也饱满，当6BA 2.0 mg/L、NAA0.5 mg/L时，原球茎形态最佳。而当6BA超过2.0 mg/L时，增殖量虽然增加，但颗粒变小，颜色也开始由绿变黄。研究认为，低浓度6BA更有利于原球茎的增殖。NAA对原球茎增殖分化影响不明显。低浓度的NAA对原球茎增殖有促进作用，高浓度的则不利[5]。所以原球茎诱导的最佳激素浓度为6BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L。
表1 各激素组合诱导原球茎的结果比较
编号 6BA
mg/L NAA
mg/L原球茎的形态
①0.50.2 颗粒小，数量少，颜色发黄
②0.51.0颗粒小，数量少，颜色微黄
③1.00.2颗粒中等，数量少，颜色微黄
④1.01.0颗粒中等，数量少，颜色微绿
⑤2.00.2质量中等，数量多，颜色鲜绿
⑥2.00.5颗粒大，数量多，颜色翠绿
⑦3.00.2颗粒小，数量多，顏色微绿
⑧3.00.5颗粒小，数量多，颜色微黄
2.1.2
蔗糖浓度对原球茎诱导的影响。
蔗糖作为培养基中的碳源，既为培养基提供能源物质又起到调节渗透压的作用。试验中蔗糖浓度分别为1.0%、2.0%、3.0%，新增原球茎的个数分别为54、80、35，原球茎形态分别为颗粒中等，颜色微绿;颗粒大，颜色鲜绿;颗粒中等，颜色微黄。可见添加1.0%和2.0%蔗糖时，新增原球茎数为54、80个，且原球茎呈绿色、颗粒状。当蔗糖浓度增加到3.0%时，此时培养基渗透压较高，前期不利于原球茎的诱导。故最佳的蔗糖浓度应为2.0%。
2.2 原球茎的增殖
选取1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L的6BA和0.2 mg/L的NAA组合（分别为1、2、3、4号培养基），原球茎的增殖快慢比较结果：1.5～2.0 mg/L的6BA有利于原球茎的增殖，繁殖速度较快，增殖数量较多，2.0 mg/L时效果最佳;浓度超过2.0 mg/L时，不利于其增殖，繁殖速度慢。NAA对原球茎的增殖作用不明显，但低浓度的NAA有协同作用[6]。所以最佳原球茎增殖培养基为 1/2MS+ 6BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。 不同激素浓度的4种培养基对原球茎增殖的影响见图1。 注：a.1号培养基;b.2号培养基;c.3号培养基;d.4号培养基
图1 不同激素浓度对原球茎增殖的影响
2.3 原球茎的分化增殖
原球茎的分化及增殖所需6BA和NAA的浓度相对较原球茎诱导及增殖的浓度要低，且两者的比值也小。6BA与NAA的浓度组合及分化结果见表2。
由表2可知，原球茎的增殖与分化主要取决于6BA浓度的大小。低浓度的6BA有利于分化，6BA浓度超过2.0 mg/L时，不促进增殖。NAA的作用亦不显著，但不加入NAA时，原球茎也难以分化出芽。所以最佳原球茎分化激素浓度为6BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L。不同激素浓度处理对原球茎分化结果见图2。
表2 不同激素浓度对原球茎分化的影响
编号6BA∥mg/L NAA∥mg/L观察结果
①0.50极少数分化
②0.50.5少数分化
③1.00.2完全分化
④1.00.5多数分化
⑤1.50.2部分增殖
⑥2.00.5多数增殖
图2 不同激素浓度对原球茎分化的影响
2.4 誘导生根
2.4.1 不同激素对诱导生根的影响。选用IBA和NAA 2种激素进行诱导生根，培养基组成及生根情况见表3。
由表3可知，IBA和NAA均能诱导生根，但两者相比，IBA诱导生根的效果比NAA更好，生根率高达90%。所以最佳诱导生根的培养基为1/2MS外加激素IBA。
表3 诱导生根的结果比较
编号基本培养基IBA
mg/L生根率
%平均根数
条
①1/2MSIBA 0.2502～3
②1/2MSIBA 0.5904～5
③1/2MSIBA 1.0843～4
④1/2MSNAA 0.2402～3
⑤1/2MSNAA 0.5633～4
⑥1/2MSNAA 1.0582～3
2.4.2
不同浓度的IBA对诱导生根率的影响。由表4可知，幼苗开始生根天数随IBA浓度的增加而缩短，IBA浓度为0.4～0.6 mg/L时，随IBA浓度的增加，组培苗的生根率、每株根数增加。当IBA浓度超过0.6 mg/L时生根率开始下降。综合比较，以IBA 0.6 mg/L组培幼苗的生根效果最好，为28 d左右，根数平均有4～5条，根长达3.5 cm，小苗生长发育正常。
2.5 炼苗与移栽
蝴蝶兰对温度要求比较严格，最适栽培温度为白天25～28 ℃，夜间18～10 ℃，蝴蝶兰不适于强烈阳光下生长，夏天要用遮阳网遮蔽阳光;基质选用水苔作基质的盆栽法，主要适用多孔塑料盆，盆高最好小于直径，盆下部用小块泡沫填充以利排水，上面用水苔填充，将小苗栽植于盆中，切不可压得太紧，以防烂根;蝴蝶兰在温度适宜条件下生长迅速，因此，其需肥量比其他兰花稍多，主要以液肥为主，春天适当多施，夏秋少施。
表4 不同浓度IBA的诱导生根的比较
IBA
mg/L生根率
%平均根
数∥条根长
cm开始生根
天数∥d
0.2581/24.236
0.4862/33.933
0.6984/53.528
0.8894/52.825
1.0843/41.721
3 结论与讨论
研究表明，诱导原球茎的最佳外植体为果荚，且果荚生长期为4个月最好;采用1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖2.0%、琼脂0.8%、有机添加物为10%香蕉泥的上清液最佳;添加活性炭2.0 g/L防止褐化效果最好。蝴蝶兰组织
培养添加激素为6BA、NAA和IBA，各阶段最佳激素及浓度