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摘 要：蛹虫草具有抗疲劳、提高机体免疫力的作用，维生素E具有抗氧化，清除体内氧自由基，免疫调节的作用。维生素C具有强还原性，与维生素E在免疫调节上具有正向协同作用。该研究使用8周递增负荷跑台训练建立大鼠运动疲劳模型，分为空白对照组（CK）、运动对照组（CKY）、运动+蛹虫草组（YCC）、运动+蛹虫草+维生素C+维生素E组（YCE）4组。运动第8周后，取全血提取总RNA反转录cDNA，采用qRT-PCR检测IL-2的表达量，并做qRT-PCR的电泳图检测IL-2的片段大小。结果表明，8周大鼠递增负荷运动后CKY组的IL-2表达量与CK组相比显著降低，YCC组表达量接近相同，YCE组表达量明显增高。根据电泳图显示，各组IL-2的条带大小（200bp）均与内参基因GAPDH大小一致，且没有明显的引物二聚体。维生素C和维生素E与蛹虫草联用能促进IL-2的表达，维生素C和维生素E对蛹虫草的免疫调节是正向协同作用。
关键词：IL-2；蛹虫草；维生素C；维生素E；免疫调节
中图分类号 R29 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0048-03
Abstract：Cordyceps militaris has anti-fatigue， improve the body immunity， vitamin E has antioxidant， remove the body free radicals， immune regulation， vitamin C has a strong reduction， and vitamin E in the immune regulation has a positive synergistic effect. Blank control group（CK）， exercise control group （CKY）， exercise + Cordyceps militaris group（YCC）， exercise + Cordyceps militaris + vitamin C + vitamin E group （YCE） 4 groups. The expression of IL-2 was detected by qRT-PCR and the size of IL-2 was detected by electrophoretic pattern detection. The results showed that the expression of IL-2 in CKY group was significantly lower than that in CK group， and the expression level of YCC group was similar to that of YCC group. YCE group expression was also significantly increased. According to the electrophoregram， the bands of IL-2 in each group were consistent with the size of GAPDH， and there was no obvious primer dimer. Vitamin C and vitamin E combined with Cordyceps militaris can make IL-2 expression up-regulated， vitamin C and vitamin E on the immune regulation of Cordyceps militaris is a positive synergistic effect.
Key words：IL-2；Cordyceps militaris；Vitamin C；Vitamin E；Immunomodulation
免疫功能低下是一種病理特征，人体免疫力就是我们的身体在面对外来的侵袭时所能抵御其侵害的能力。在机体面对外来感染时，免疫细胞产生大量氧自由基抵御感染。同时，大量的氧自由基也损害了自身的免疫细胞[1]。比如无处不在的细菌、病毒向人体进攻时，身体抵抗能力的好与坏直接决定了是否会被感染。免疫功能降低的症状包括：经常发生伤风和流感，经常治愈的寄生虫感染又复发。研究发现，许多疾病都与过氧化脂质的产生有关，免疫功能降低，抗氧化营养素，如维生素C、维生素E等有消除自由基的抗氧化作用，抗氧化维生素对免疫调节可以弥补和提高机体的免疫反应[2]。同时一些抗氧化素有协同作用。
蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草、北虫草[3]，其主要成分是虫草多糖，具有提高免疫力，延缓衰老、扶正固体、保护心脏、肝脏、抗癌的作用。蛹虫草提取物具有调节小鼠体内免疫调节作用，可减轻内毒素或类似物质引起的炎症，具有一定的免疫保护作用[4]。国内外研究证实，蛹虫草的机制主要归功于免疫调节[3-5]。
维生素E是生育酚和三烯生育酚的总称，是一种脂溶性维生素，具有很强的抗氧化和清除氧自由基的效果[2]。维生素E在细胞内的主要作用是抗氧化，防止细胞内和膜内的不饱和脂肪酸被氧化而破坏，保证其完整性[6]。维生素E在正常的免疫功能中发挥作用，尤其是对于淋巴细胞，这一作用已经在动物模型和美国老年人群中得到证实[7]。
维生素C有L型和D型2种异构体，只有L型具有生理功能，还原型和氧化型都具有生理活性[8]。维生素C是一种水溶性维生素，最重要的是强还原性的分子特征，并与维生素E产生协同作用，降低脂质过氧化、超氧化物歧化酶的生成，保护超氧化酶活性，清除氧自由基，提高机体免疫功能[8]。 通过研究发现，具有有规律的中小强度运动习惯的人群寿命和生活质量优于很少或者不运动人群[9]。然而，由于大强度运动导致的运动性免疫机能失衡，长期大强度运动人群，尤其在中老年阶段仍进行大强度训练可能降低生活质量和缩短寿命[9]。在运动免疫领域，由运动员高负荷运动导致的T淋巴细胞免疫失衡和Th1/Th2免疫失衡的抑制，在免疫水平的维持引起过度的注意[10-11]。
白细胞介素2（IL-2）：分子量为1.5万的糖蛋白，对T细胞激活及生长起着重要作用[12]。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应[13]。IL-2可将B细胞分化成可产生活化细胞免疫球蛋白的细胞[14]。
本研究采用跑台递增负荷运动建立大鼠疲劳模型，通过qRT-PCR检测II-2的表达量及电泳图检测IL-2片段的大小进行结果分析。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 实验动物 24只四周龄SD雌性大鼠，由北京通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK（京）。
1.1.2 仪器与试剂 LDZM立式压力灭菌器：由上海申安医疗器械厂生产；实时定量PCR仪：设备型号FQD-96A；PCR仪：型号GD35-TP600；电泳仪：由北京市六一仪器厂生产，型号DYY-6C型；冷CCD凝胶成像分析仪：型号GL；IL-2总RNA的提取试剂盒，维生素C泡腾片：拜耳医药保健公司，规格：1000mg/片，批号H20056946；维生素E软胶囊：浙江医药股份有限公司，规格：100mg/粒，批号：H33020187；蛹虫草：湖北众菇善年生物技术有限公司。
1.2 方法 疲劳型大鼠模型的建立，疲劳是指机体生理过程不能持续其机能在一定水平上，或不能维持特定的运动强度[13]。在研究运动疲劳和恢复过程中，疲劳是研究运动疲劳发生和恢复的先决条件。大鼠疲劳模型的建立主要是以跑步机为训练模式。根据自身实验研究的需要，建立不同时期的疲劳模型。大部分受训是7周递增负荷跑步机运动模式，大鼠运动负荷递增，第7周训练开始力竭。力竭判断标准主要有大鼠跟不上实验预定速度，表现为臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带后拖达30s以上；对连续的光、声、机械刺激无反应；出现呼吸深急，精神疲惫，俯卧位垂头，刺激后无反应等行为特征[10]。值得注意的是，在实际建模过程中，根据自己的实验具体情况适当调整运动负荷或运动时间。本研究参照上海体育学院王茹，陈佩杰[15]等的跑台运动模型进行训练设计。具体的跑台训练负荷见表1。
将买回来的大鼠放在饲养室饲养7d，让其适应饲养室的环境。7d后按照本实验要求随机分成4个组，每组6只。空白对照组（CK）：置于笼中自然生长，不参与跑台训练，在其他组训练完后同时给予与蛹虫草组相同剂量的0.9%生理盐水；训练对照组（CKY）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在跑台训练后即刻灌胃与蛹虫草组相同剂量的0.9%生理盐水；训练+蛹虫草组（YCC）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在每次跑台训练后即刻灌胃蛹虫草水溶液（按照蛹虫草400mg/kg体重计算）；训练+蛹虫草+VC+VE组（YCE）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在每次跑台训练后即刻灌胃蛹虫草+VC+VE水溶液（按照蛹虫草400mg/kg、VC和VE均是5.0mg/kg体重计算），自由进食饮水。
经过8周的递增负荷训练建立疲劳模型，第九周从大鼠眼眶后静脉从取其全血。将同一组的大鼠全血各取1mL于一个新的离心管中充分混合，提取总RNA。反转录成cDNA，放在-20℃备用。应用Premier Premier 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表2）。
2 结果与分析
2.1 引物质量检测 图1中2、3、4、5泳道是GAPDH内参基因，6、7、8、9泳道是IL-2基因。从PCR琼脂糖凝胶电泳图中可以清晰的看出IL-2与内参条带大小都为单一的条带，无明顯引物二聚体，说明引物质量可靠，可用于qRT-PCR研究。
2.2 qRT-PCR检测结果 从图2可以看出，以CK组的IL-2的表达作为参照，CKY组的IL-2表达倍数显著减少；YCC组的IL-2表达倍数比CK组IL-2的表达倍数略高；YCE组的IL-2表达倍数比CK组IL-2的表达倍数显著增高。
3 讨论
长期坚持低中等强度的运动会提高机体健康、生活质量，延长寿命等。但是大强度的运动会导致运动性机体免疫平衡失调，降低机体健康水平。低等强度训练初期运动有助于大鼠免疫力的提高，各运动组大鼠体重及其饮食量与饲养时间成正相关增长。但是随着运动负荷的增大，破坏了运动组大鼠免疫系统的平衡，在没有给予任何提高机体免疫力药物的CKY组大鼠出现一系列如体重增长缓慢、进食量减少、毛发凌乱、打喷嚏、对外界刺激敏感性降低等现象。大强度运动后会造成大鼠免疫力的减弱，蛹虫草基本可以抵抗大鼠大强度运动后疲劳引起的免疫调节能力降低，而维生素C和维生素E与蛹虫草联用不仅可以抵抗大鼠高负荷运动疲劳引起的免疫调节能力低下，还能在一定程度上增强大鼠的免疫调节能力。
参考文献
[1]杨志蕃，延娟，刘军，等.不同维生素免疫调节作用在鼠疟模型中的实验观察[J].微生物学杂志，2013，12：75-79.
[2]于波.维生素E对机体免疫功能的影响[J].赤峰学院学报，2015，35（1）：195-196.
[3]樊慧婷，林洪生.蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，8：2549-2552.
[4]蒋志涛，戴国梁，潘金火，等.蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J].现代中药研究与实践，2015，5（29）：80-83. [5]Hwan H . L .， SeμLki L .， Hyosun C.， et aL. Anti-cancer effect of Cordyceps miLitaris in human coLorectaL carcinoma RKO ceLLs via ceLL cycLe arrest and mitochondriaL apoptosis[J].DARU JounaL of PharmaceuticaL Sciences，2015，23（1）.
[6]朱长林，张文彬，孙鹏等.维生素C和维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用[J].中国临床康复，2006，10（36）：120-122.
[7]Jeng KC.，Yang CS.，Siu WY，et al .Supplemenlalion with vitamins C and E enhances cytokkine proudution by peripheral blood mononuclear cells in healthy adults[J].Am J Clin Nutr 1996，64（6）： 960-965.
[8]孫秀川.维生素C对机体免疫功能的影响[J].内蒙古医学杂志，2014，46（2）：174-176.
[9]罗贝贝，陈佩杰.运动免疫学研究的现状与展望[J].上海体育学院运动科学学院，2014：271-27.
[10]刘倩.蛹虫草对运动疲劳大鼠Th1/Th2免疫平衡影响的研究[D].济南：山东体育学院，2014.
[11]田雪文，刘倩，黄超，等.蛹虫草对过度运动大鼠T淋巴细胞免疫抑制的调节研究[J].山东体育学院学报，2013，6：41-45.
[12]赵定亮，单风平.白细胞介素-2最新研究进展[J].微生物学杂志，2013，8（33）：77-82.
[13]赵可伟.运动对白细胞介素-1、白细胞介素-2与白细胞介素-6影响的研究进展[J].首都体育学院学报，2005，5（17）：43-67.
[14]翟志敏.IL-2对免疫激活和免疫耐受的双向调节作用[J].中国药理学通报，2013，29（3）：319-322.
[15]王茹，陈佩杰.CD 4+CD 25+调节性T细胞在大鼠递增负荷过度训练中的表达及其免疫调节功能[J].上海体育学院学报，2010，34（3）：49-56.
（责编：张宏民）
关键词：IL-2；蛹虫草；维生素C；维生素E；免疫调节
中图分类号 R29 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0048-03
Abstract：Cordyceps militaris has anti-fatigue， improve the body immunity， vitamin E has antioxidant， remove the body free radicals， immune regulation， vitamin C has a strong reduction， and vitamin E in the immune regulation has a positive synergistic effect. Blank control group（CK）， exercise control group （CKY）， exercise + Cordyceps militaris group（YCC）， exercise + Cordyceps militaris + vitamin C + vitamin E group （YCE） 4 groups. The expression of IL-2 was detected by qRT-PCR and the size of IL-2 was detected by electrophoretic pattern detection. The results showed that the expression of IL-2 in CKY group was significantly lower than that in CK group， and the expression level of YCC group was similar to that of YCC group. YCE group expression was also significantly increased. According to the electrophoregram， the bands of IL-2 in each group were consistent with the size of GAPDH， and there was no obvious primer dimer. Vitamin C and vitamin E combined with Cordyceps militaris can make IL-2 expression up-regulated， vitamin C and vitamin E on the immune regulation of Cordyceps militaris is a positive synergistic effect.
Key words：IL-2；Cordyceps militaris；Vitamin C；Vitamin E；Immunomodulation
免疫功能低下是一種病理特征，人体免疫力就是我们的身体在面对外来的侵袭时所能抵御其侵害的能力。在机体面对外来感染时，免疫细胞产生大量氧自由基抵御感染。同时，大量的氧自由基也损害了自身的免疫细胞[1]。比如无处不在的细菌、病毒向人体进攻时，身体抵抗能力的好与坏直接决定了是否会被感染。免疫功能降低的症状包括：经常发生伤风和流感，经常治愈的寄生虫感染又复发。研究发现，许多疾病都与过氧化脂质的产生有关，免疫功能降低，抗氧化营养素，如维生素C、维生素E等有消除自由基的抗氧化作用，抗氧化维生素对免疫调节可以弥补和提高机体的免疫反应[2]。同时一些抗氧化素有协同作用。
蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草、北虫草[3]，其主要成分是虫草多糖，具有提高免疫力，延缓衰老、扶正固体、保护心脏、肝脏、抗癌的作用。蛹虫草提取物具有调节小鼠体内免疫调节作用，可减轻内毒素或类似物质引起的炎症，具有一定的免疫保护作用[4]。国内外研究证实，蛹虫草的机制主要归功于免疫调节[3-5]。
维生素E是生育酚和三烯生育酚的总称，是一种脂溶性维生素，具有很强的抗氧化和清除氧自由基的效果[2]。维生素E在细胞内的主要作用是抗氧化，防止细胞内和膜内的不饱和脂肪酸被氧化而破坏，保证其完整性[6]。维生素E在正常的免疫功能中发挥作用，尤其是对于淋巴细胞，这一作用已经在动物模型和美国老年人群中得到证实[7]。
维生素C有L型和D型2种异构体，只有L型具有生理功能，还原型和氧化型都具有生理活性[8]。维生素C是一种水溶性维生素，最重要的是强还原性的分子特征，并与维生素E产生协同作用，降低脂质过氧化、超氧化物歧化酶的生成，保护超氧化酶活性，清除氧自由基，提高机体免疫功能[8]。 通过研究发现，具有有规律的中小强度运动习惯的人群寿命和生活质量优于很少或者不运动人群[9]。然而，由于大强度运动导致的运动性免疫机能失衡，长期大强度运动人群，尤其在中老年阶段仍进行大强度训练可能降低生活质量和缩短寿命[9]。在运动免疫领域，由运动员高负荷运动导致的T淋巴细胞免疫失衡和Th1/Th2免疫失衡的抑制，在免疫水平的维持引起过度的注意[10-11]。
白细胞介素2（IL-2）：分子量为1.5万的糖蛋白，对T细胞激活及生长起着重要作用[12]。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应[13]。IL-2可将B细胞分化成可产生活化细胞免疫球蛋白的细胞[14]。
本研究采用跑台递增负荷运动建立大鼠疲劳模型，通过qRT-PCR检测II-2的表达量及电泳图检测IL-2片段的大小进行结果分析。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 实验动物 24只四周龄SD雌性大鼠，由北京通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK（京）。
1.1.2 仪器与试剂 LDZM立式压力灭菌器：由上海申安医疗器械厂生产；实时定量PCR仪：设备型号FQD-96A；PCR仪：型号GD35-TP600；电泳仪：由北京市六一仪器厂生产，型号DYY-6C型；冷CCD凝胶成像分析仪：型号GL；IL-2总RNA的提取试剂盒，维生素C泡腾片：拜耳医药保健公司，规格：1000mg/片，批号H20056946；维生素E软胶囊：浙江医药股份有限公司，规格：100mg/粒，批号：H33020187；蛹虫草：湖北众菇善年生物技术有限公司。
1.2 方法 疲劳型大鼠模型的建立，疲劳是指机体生理过程不能持续其机能在一定水平上，或不能维持特定的运动强度[13]。在研究运动疲劳和恢复过程中，疲劳是研究运动疲劳发生和恢复的先决条件。大鼠疲劳模型的建立主要是以跑步机为训练模式。根据自身实验研究的需要，建立不同时期的疲劳模型。大部分受训是7周递增负荷跑步机运动模式，大鼠运动负荷递增，第7周训练开始力竭。力竭判断标准主要有大鼠跟不上实验预定速度，表现为臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带后拖达30s以上；对连续的光、声、机械刺激无反应；出现呼吸深急，精神疲惫，俯卧位垂头，刺激后无反应等行为特征[10]。值得注意的是，在实际建模过程中，根据自己的实验具体情况适当调整运动负荷或运动时间。本研究参照上海体育学院王茹，陈佩杰[15]等的跑台运动模型进行训练设计。具体的跑台训练负荷见表1。
将买回来的大鼠放在饲养室饲养7d，让其适应饲养室的环境。7d后按照本实验要求随机分成4个组，每组6只。空白对照组（CK）：置于笼中自然生长，不参与跑台训练，在其他组训练完后同时给予与蛹虫草组相同剂量的0.9%生理盐水；训练对照组（CKY）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在跑台训练后即刻灌胃与蛹虫草组相同剂量的0.9%生理盐水；训练+蛹虫草组（YCC）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在每次跑台训练后即刻灌胃蛹虫草水溶液（按照蛹虫草400mg/kg体重计算）；训练+蛹虫草+VC+VE组（YCE）：本实验设计的运动疲劳模型，进行跑台训练，并在每次跑台训练后即刻灌胃蛹虫草+VC+VE水溶液（按照蛹虫草400mg/kg、VC和VE均是5.0mg/kg体重计算），自由进食饮水。
经过8周的递增负荷训练建立疲劳模型，第九周从大鼠眼眶后静脉从取其全血。将同一组的大鼠全血各取1mL于一个新的离心管中充分混合，提取总RNA。反转录成cDNA，放在-20℃备用。应用Premier Premier 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表2）。
2 结果与分析
2.1 引物质量检测 图1中2、3、4、5泳道是GAPDH内参基因，6、7、8、9泳道是IL-2基因。从PCR琼脂糖凝胶电泳图中可以清晰的看出IL-2与内参条带大小都为单一的条带，无明顯引物二聚体，说明引物质量可靠，可用于qRT-PCR研究。
2.2 qRT-PCR检测结果 从图2可以看出，以CK组的IL-2的表达作为参照，CKY组的IL-2表达倍数显著减少；YCC组的IL-2表达倍数比CK组IL-2的表达倍数略高；YCE组的IL-2表达倍数比CK组IL-2的表达倍数显著增高。
3 讨论
长期坚持低中等强度的运动会提高机体健康、生活质量，延长寿命等。但是大强度的运动会导致运动性机体免疫平衡失调，降低机体健康水平。低等强度训练初期运动有助于大鼠免疫力的提高，各运动组大鼠体重及其饮食量与饲养时间成正相关增长。但是随着运动负荷的增大，破坏了运动组大鼠免疫系统的平衡，在没有给予任何提高机体免疫力药物的CKY组大鼠出现一系列如体重增长缓慢、进食量减少、毛发凌乱、打喷嚏、对外界刺激敏感性降低等现象。大强度运动后会造成大鼠免疫力的减弱，蛹虫草基本可以抵抗大鼠大强度运动后疲劳引起的免疫调节能力降低，而维生素C和维生素E与蛹虫草联用不仅可以抵抗大鼠高负荷运动疲劳引起的免疫调节能力低下，还能在一定程度上增强大鼠的免疫调节能力。
参考文献
[1]杨志蕃，延娟，刘军，等.不同维生素免疫调节作用在鼠疟模型中的实验观察[J].微生物学杂志，2013，12：75-79.
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[4]蒋志涛，戴国梁，潘金火，等.蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J].现代中药研究与实践，2015，5（29）：80-83. [5]Hwan H . L .， SeμLki L .， Hyosun C.， et aL. Anti-cancer effect of Cordyceps miLitaris in human coLorectaL carcinoma RKO ceLLs via ceLL cycLe arrest and mitochondriaL apoptosis[J].DARU JounaL of PharmaceuticaL Sciences，2015，23（1）.
[6]朱长林，张文彬，孙鹏等.维生素C和维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用[J].中国临床康复，2006，10（36）：120-122.
[7]Jeng KC.，Yang CS.，Siu WY，et al .Supplemenlalion with vitamins C and E enhances cytokkine proudution by peripheral blood mononuclear cells in healthy adults[J].Am J Clin Nutr 1996，64（6）： 960-965.
[8]孫秀川.维生素C对机体免疫功能的影响[J].内蒙古医学杂志，2014，46（2）：174-176.
[9]罗贝贝，陈佩杰.运动免疫学研究的现状与展望[J].上海体育学院运动科学学院，2014：271-27.
[10]刘倩.蛹虫草对运动疲劳大鼠Th1/Th2免疫平衡影响的研究[D].济南：山东体育学院，2014.
[11]田雪文，刘倩，黄超，等.蛹虫草对过度运动大鼠T淋巴细胞免疫抑制的调节研究[J].山东体育学院学报，2013，6：41-45.
[12]赵定亮，单风平.白细胞介素-2最新研究进展[J].微生物学杂志，2013，8（33）：77-82.
[13]赵可伟.运动对白细胞介素-1、白细胞介素-2与白细胞介素-6影响的研究进展[J].首都体育学院学报，2005，5（17）：43-67.
[14]翟志敏.IL-2对免疫激活和免疫耐受的双向调节作用[J].中国药理学通报，2013，29（3）：319-322.
[15]王茹，陈佩杰.CD 4+CD 25+调节性T细胞在大鼠递增负荷过度训练中的表达及其免疫调节功能[J].上海体育学院学报，2010，34（3）：49-56.
（责编：张宏民）