【摘 要】
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为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体，并验证载体的有效性，试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区（CDS）序列，得到DEPTOR基因片段，同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上，获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGr
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31760334）； 广西教育厅科研项目（2019KY0048）；
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为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体，并验证载体的有效性，试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区（CDS）序列，得到DEPTOR基因片段，同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上，获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上，获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞，72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞，RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法，将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞，72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞，采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：用构建的过表达载体pEGFP-DEPTOR和pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1转染HEK 293T细胞后均能观察到绿色荧光蛋白的表达，RT-PCR能扩增出相应条带，即慢病毒感染法能成功将DEPTOR基因转入细胞内。构建的shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508能有效降低DEPTOR基因的表达，与未干扰相比差异显著（P＜0.05）,干扰效率约为80%。说明试验成功构建出DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体。
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