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摘要：对前人已预测的大豆miRNA的4个茎环结构进行引物设计、克隆miRNA前体，先将设计好的接头与大豆小RNA的3′末端连接，然后利用与接头序列互补的引物对小RNA进行反转录，即可得到加接头的第1链cDNA，再用基因特异引物GSP和通用接头引物的组合，经PCR扩增后即可捕获位于已知序列区和接头之间的3′端RNA序列。结合3′端引物的测序结果，初步预测成熟miRNA可能的6个组合是同一家族。
关键词：miRNA；EPSPS（5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）；基因序列；草甘膦；克隆
中图分类号： S482.4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）09-0024-04
草甘膦是一类具有特异性，且能有效抑制叶绿体酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的除草剂[1-2]。对EPSPS作用的草甘膦能阻断莽草酸酯途径，通过竞争性抑制磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）与EPSPS结合，形成稳定的三元络合物，从而阻断PEP与3-磷酸莽草酸（S3P）反应生成EPSPS，最终阻止芳香族氨基酸的生物合成，抑制芳香族氨基酸的生成，导致植物死亡[3-4]。
microRNA（miRNA）是指真核生物中长度约为21～25 nt的小型内源的非编码单链RNA家族。microRNA是Lee等于1993年在线虫中首次发现的。此后，大量的microRNA在植物和动物中被发现和克隆[5]，到目前为止，植物中发现的microRNA分子已逾200种[6]。microRNA是近年来非编码RNA研究的热点。它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达，可以在转录后水平对许多基因的表达起着重要的调控作用[7]。miRNA通过2种途径发挥其作用：（1）miRNA与靶mRNA序列不完全互补，它主要通过与靶mRNA的不完全互补配对进而阻抑mRNA的翻译过程，这种途径对mRNA的稳定性无任何影响，属于翻译水平基因调节；（2）miRNA与靶mRNA序列完全互补，它可以通过与小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）类似的途径与靶mRNA完全互补配对进而降解靶mRNA，属于转录后水平基因调节[8]。
在各类小分子RNA中，miRNA具有最广泛的基因调节功能[9]，内含子miRNA具有反向调节其宿主基因的功能[10-11]，可能有以下几种情况：（1）当宿主基因是内含子miRNA的靶基因时，内含子miRNA直接下调宿主基因的表达，抑制其功能的发挥，这是直接作用。譬如，内含子miR-204被预测可直接靶向其宿主基因[WTBX][STBX]TRPM3[WTBZ][STBZ][12]。（2）内含子miRNA还可以通过下调促进宿主基因功能的靶基因，从而拮抗宿主基因的功能。目前还未见有这方面的试验证据，但不能否定这种情况存在的可能性。文献报道内含子miR-25的可能靶基因是[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]基因，而FHL2蛋白则通过与宿主基因编码的蛋白MCM7相互作用从而促进其功能[13]。因此，我们推测内含子miR-25有可能有反向调节宿主基因[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]的功能，当然这还有待今后进一步试验证实。拟南芥中的miR160通过负调控生长素响应因子（auxin response factors）ARF10和ARF16的表达而控制根冠细胞的形成[14]。玉米中的GL15活性增高不仅使幼年期叶片增多，而且延缓生殖发育，而miR172对GL15mRNA水平进行负调控，从而促进玉米幼叶向成熟叶片转变[15]。贾小云等发现，miR828可以通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达，进而负调控番茄植株中花青素的生物合成[2]。这些都表明植物中miRNA具有负反馈调节机制[16]。
本研究对前人预测的除草剂作用靶标酶的大豆miRNA的4个茎环结构进行引物设计，克隆miRNA前体，从而进一步研究它们在植物生长发育中的生物学意义和分子水平上的调节机制，而且还可以有目的、有计划地利用它们进行植物生长发育的调控和生理结构的改造，使植物更大限度地表现出对人类研究有利的性状，从而为人类生产生活造福。
1 材料与方法
1.1 供试材料
大豆基因组EST序列数据库来源：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；RNA-fold predict：http：//frontend.bioinfo.rpi.edu/zukerm/home.html；Mipred confirm：http：//www.bioinf.seu.edu.cn。
1.2 试验方法
利用生物信息学方法，对不同除草剂作用靶标酶EST序列进行miRNA预测。通过RNA-fold predict软件对原始EST序列预测，初步得到12个microRNA二级结构，利用Mipred confirm（http：//www.bioinf.seu.edu.cn）进一步筛选，共筛选到4个miRNA前体，其中2个EPSP合成酶、1个谷氨酰胺合成酶、1个原卟啉原氧化酶。
本试验中，先将设计好的接头与大豆小RNA的3′末端连接，然后利用与接头序列互补的引物对小RNA进行反转录，即可得到加接头的第1链cDNA；再用基因特异引物GSP和通用接头引物的组合，经PCR扩增即可捕获位于已知序列区和接头之间的3′ 端RNA序列。
1.2.1 连接3′接头 3′接头序列：5′-PO4-UUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTC（idT）-3′。首先将总RNA与3′接头均匀混合，80 ℃下处理2 min后置于冰中冷却。配制反应体系：无核酸酶的水18.6 μL、10×T4 RNA 连接酶缓冲液[不含牛血清白蛋白（BSA-free）]4.0 μL、BSA（0.1%）2.4 μL 、3′接头2.0 μL、总RNA 11 μL、T4 RNA连接酶（40 U/μL）2.0 μL（100 μmol/L），5 ℃反应16 h后，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA终止反应；70 ℃下处理10 min以灭活连接酶，之后置于冰中保存。需要注意的是，配制反应体系时须按照以下顺序：无核酸酶的水→10×T4 RNA连接酶缓冲液→0.1% BSA→总RNA
关键词：miRNA；EPSPS（5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）；基因序列；草甘膦；克隆
中图分类号： S482.4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）09-0024-04
草甘膦是一类具有特异性，且能有效抑制叶绿体酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的除草剂[1-2]。对EPSPS作用的草甘膦能阻断莽草酸酯途径，通过竞争性抑制磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）与EPSPS结合，形成稳定的三元络合物，从而阻断PEP与3-磷酸莽草酸（S3P）反应生成EPSPS，最终阻止芳香族氨基酸的生物合成，抑制芳香族氨基酸的生成，导致植物死亡[3-4]。
microRNA（miRNA）是指真核生物中长度约为21～25 nt的小型内源的非编码单链RNA家族。microRNA是Lee等于1993年在线虫中首次发现的。此后，大量的microRNA在植物和动物中被发现和克隆[5]，到目前为止，植物中发现的microRNA分子已逾200种[6]。microRNA是近年来非编码RNA研究的热点。它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达，可以在转录后水平对许多基因的表达起着重要的调控作用[7]。miRNA通过2种途径发挥其作用：（1）miRNA与靶mRNA序列不完全互补，它主要通过与靶mRNA的不完全互补配对进而阻抑mRNA的翻译过程，这种途径对mRNA的稳定性无任何影响，属于翻译水平基因调节；（2）miRNA与靶mRNA序列完全互补，它可以通过与小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）类似的途径与靶mRNA完全互补配对进而降解靶mRNA，属于转录后水平基因调节[8]。
在各类小分子RNA中，miRNA具有最广泛的基因调节功能[9]，内含子miRNA具有反向调节其宿主基因的功能[10-11]，可能有以下几种情况：（1）当宿主基因是内含子miRNA的靶基因时，内含子miRNA直接下调宿主基因的表达，抑制其功能的发挥，这是直接作用。譬如，内含子miR-204被预测可直接靶向其宿主基因[WTBX][STBX]TRPM3[WTBZ][STBZ][12]。（2）内含子miRNA还可以通过下调促进宿主基因功能的靶基因，从而拮抗宿主基因的功能。目前还未见有这方面的试验证据，但不能否定这种情况存在的可能性。文献报道内含子miR-25的可能靶基因是[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]基因，而FHL2蛋白则通过与宿主基因编码的蛋白MCM7相互作用从而促进其功能[13]。因此，我们推测内含子miR-25有可能有反向调节宿主基因[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]的功能，当然这还有待今后进一步试验证实。拟南芥中的miR160通过负调控生长素响应因子（auxin response factors）ARF10和ARF16的表达而控制根冠细胞的形成[14]。玉米中的GL15活性增高不仅使幼年期叶片增多，而且延缓生殖发育，而miR172对GL15mRNA水平进行负调控，从而促进玉米幼叶向成熟叶片转变[15]。贾小云等发现，miR828可以通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达，进而负调控番茄植株中花青素的生物合成[2]。这些都表明植物中miRNA具有负反馈调节机制[16]。
本研究对前人预测的除草剂作用靶标酶的大豆miRNA的4个茎环结构进行引物设计，克隆miRNA前体，从而进一步研究它们在植物生长发育中的生物学意义和分子水平上的调节机制，而且还可以有目的、有计划地利用它们进行植物生长发育的调控和生理结构的改造，使植物更大限度地表现出对人类研究有利的性状，从而为人类生产生活造福。
1 材料与方法
1.1 供试材料
大豆基因组EST序列数据库来源：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；RNA-fold predict：http：//frontend.bioinfo.rpi.edu/zukerm/home.html；Mipred confirm：http：//www.bioinf.seu.edu.cn。
1.2 试验方法
利用生物信息学方法，对不同除草剂作用靶标酶EST序列进行miRNA预测。通过RNA-fold predict软件对原始EST序列预测，初步得到12个microRNA二级结构，利用Mipred confirm（http：//www.bioinf.seu.edu.cn）进一步筛选，共筛选到4个miRNA前体，其中2个EPSP合成酶、1个谷氨酰胺合成酶、1个原卟啉原氧化酶。
本试验中，先将设计好的接头与大豆小RNA的3′末端连接，然后利用与接头序列互补的引物对小RNA进行反转录，即可得到加接头的第1链cDNA；再用基因特异引物GSP和通用接头引物的组合，经PCR扩增即可捕获位于已知序列区和接头之间的3′ 端RNA序列。
1.2.1 连接3′接头 3′接头序列：5′-PO4-UUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTC（idT）-3′。首先将总RNA与3′接头均匀混合，80 ℃下处理2 min后置于冰中冷却。配制反应体系：无核酸酶的水18.6 μL、10×T4 RNA 连接酶缓冲液[不含牛血清白蛋白（BSA-free）]4.0 μL、BSA（0.1%）2.4 μL 、3′接头2.0 μL、总RNA 11 μL、T4 RNA连接酶（40 U/μL）2.0 μL（100 μmol/L），5 ℃反应16 h后，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA终止反应；70 ℃下处理10 min以灭活连接酶，之后置于冰中保存。需要注意的是，配制反应体系时须按照以下顺序：无核酸酶的水→10×T4 RNA连接酶缓冲液→0.1% BSA→总RNA