【摘 要】
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目的 阐明17β-E2介导GPR30/AMPK/mTOR通路调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的具体作用机制.方法 体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞,使用不同浓度的17β-E2处理细胞,并按照分组选
【机 构】
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株洲市中心医院(中南大学湘雅医学院附属株洲医院) ,湖南 株洲412007
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目的 阐明17β-E2介导GPR30/AMPK/mTOR通路调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的具体作用机制.方法 体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞,使用不同浓度的17β-E2处理细胞,并按照分组选择性应用G15(GPR30抑制剂)或Compound C(AMPK抑制剂).使用实时定量PCR技术与Western blot方法分别检测MC3T3-E1细胞内GPR30 mRNA与蛋白的表达水平;使用免疫荧光检测技术进一步观察GPR30在MC3T3-E1细胞中的表达及定位情况;应用Western blot方法检测线粒体自噬相关蛋白LC3、Tom20、Hsp60以及信号通路蛋白AMPK、mTOR的表达水平;应用透射电子显微镜观察成骨细胞中线粒体自噬小体的形成情况.结果 ①GPR30在MC3T3-E1细胞中存在内源性表达,17β-E2能提高MC3T3-E1细胞中GPR30的mRNA与蛋白表达水平,当雌二醇浓度为10-7 mol/L时促进作用最强.GPR30特异性抑制剂G15可以阻断17β-E2对GPR30蛋白表达的促进作用.②17β-E2能提高MC3T3-E1细胞内线粒体自噬相关蛋白LC3、Tom20、Hsp60的表达水平,GPR30特异性抑制剂G15可以阻断17β-E2对线粒体自噬相关蛋白表达的促进作用.③透射电子显微镜观察结果显示,17β-E2能促进MC3T3-E1细胞中线粒体自噬小体的生成.④17β-E2能增加MC3T3-E1细胞中信号通路AMPK蛋白的磷酸化水平,并降低信号通路下游分子mTOR蛋白的磷酸化水平,给予AMPK抑制剂Compound C后,信号通路AMPK蛋白的磷酸化水平降低.结论 17β-E2能够促进MC3T3-E1成骨细胞内GPR30的表达,并且能通过作用于GPR30来激活细胞内AMPK/mTOR信号通路,诱导MC3T3-E1成骨细胞发生线粒体自噬.
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