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摘要 [目的]建立白及、黄花白及、小白及的化学成分特征色谱图，寻找能够分类鉴别白及属植物的方法。[方法]运用薄层色谱和高效液相色谱对白及、黄花白及和小白及进行化学成分的色谱图研究，以1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militaeine）作为标准品对三者的化学成分进行比对分析。[结果]薄层色谱显示，白及、黄花白及和小白及3个种具有相似或相同的化学成分，其中黄花白及和小白及的含量少于白及;经过HPLC图谱比较，三者的militaeine成分含量差别较大，白及为最高，黄花白及次之，小白及没有测出该成分。[结论]白及、小白及、黄花白及所含化学成分类似，可为三者等同药用评价提供参考依据;三者化学成分含量的差异为白及作为正品中药白及的唯一基源植物提供了一定的科学依据。
关键词 白及属;化学成分;薄层色谱;高效液相色谱;分类鉴别
中图分类号 R 284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）19-0173-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.045
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Analysis of Chemical Constituents of Three Species Plants of Bletilla Reichb.f.
YANG Li-yun， CHENG Yuan-hui， SU Ze-chun et al
（Alpine Economic Plant Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Lijiang，Yunnan 674199）
Abstract [Objective]To establish the characteristic chromatograms of the chemical constituents of Bletilla striata， Bletilla ochracea and Bletilla formosana ， and in order to find a method to classify and identify Bletilla Reichb.f.[Method]TLC and HPLC were used to study the chromatograph of the chemical constituents of B. striata， B. ochracea and B.formosanar ， militaine was used as a standard product to compare and analyze the chemical composition of the three.[Result]TLC showed that three species had similar or identical chemical components， but the content in B.ochracea and B.formosanar was less than in B. striata .HPLC showed that militaeine chemical components were the highest in B. striata and the second in B.ochracea， but not detected in B. formosanar by HPLC.[Conclusion]The chemical constituents of three species are similar， which can provide reference for their equivalent medical use to some extent. The difference of the chemical components contents of three species provides a scientific basis for B. striata as the only original plant for the authentic traditional Chinese medicine.
Key words Bletilla Reichb.f;Chemical components;TLC;HPLC;Classified identification
基金項目 云南省农业科学院应用基础研究面上项目（YJM201713）。
作者简介 杨丽云（1971—），女，云南玉龙人，研究员，从事药用植物栽培与资源评价研究。
*通信作者，工程师，硕士，从事天然药物与芳香植物研究。
收稿日期 2021-05-17
白及属（ Bletilla Reichb.f.）植物中国有4种，分别为白及[ Bletilla striata （Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.]、黄花白及（ Bletilla ochracea Schltr.）、小白及[ Bletilla formosana （Hayata）Schltr.]和华白及[ Bletilla sinensis （Rolfe）Schltr.][1]。该属植物不仅具有较高的观赏价值，也是我国重要的中药材，开发利用价值巨大。中药材白及为白及植物的干燥假鳞茎，具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咳血、溃疡病出血[2]。现代药理研究表明，白及药用功能广泛，药用价值高，具有止血、抗菌、抗炎镇痛、抗胃溃疡、抗肿瘤、抗硅肺、促进创面愈合、增强免疫力、保护消化道黏膜、促进血管内皮细胞生长及保护肝损伤等药理作用[3-12];白及多糖除了具有良好的药理活性外，同时还表现出良好的生物可降解性、生物相容性以及结构可修饰性，是应用前景广阔的生物材料，在传统药用剂型中用作栓塞剂基质、水凝胶基质、医用敷料材料、成膜材料，也在靶向给药系统以及生物组织工程等方面表现出了良好的应用空间和应用前景[13-15]。白及多糖还作为保湿美白剂应用于化妆品工业[16-17]。 云南省是白及属植物的主要分布区及主要药材产区之一[18]，4 种白及属植物中，小白及广泛分布于云南大部分地区;黄花白及主要分布于滇中地区和滇西北地区;华白及为云南特有，模式标本采自云南蒙自，现野生资源已极度濒危;在《中国植物志》[1]和《云南植物志》[19]及有关文献[20]记载云南境内并无白及这个种的自然分布，但有研究显示云南省是珍稀药用植物白及的潜在最适分布区[21]。在云南，黄花白及、小白及一直作为白及的地方习用品或代用品使用，但作为传统中药材仅白及一种列入《中华人民共和国药典》作为中药材白及的唯一基源植物[2]。这些地方习用品的等效性、合理合法性亟待进行综合评价及评估。该研究对白及、黄花白及、小白及进行化学成分的色谱图分析，了解主要活性成分方面的种间特征及差异，寻找能够分类鉴别白及属植物的特征，为云南白及属资源开发利用及白及属植物药用通用的合理性、有效性及安全性研究提供新的思路与科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与设备。1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（梯度泵、柱温箱、多波长紫外检测器、自动进样器，安捷伦科技有限公司）;Zorbax SB-C 18色谱柱（100 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司）;N-1300V-WB旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）;SB-1300调温水浴锅（东京理化器械株式会社）;超声波振荡器（日本精机制作所）;电子天平（梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）;GF254薄层色谱硅胶板（青岛海洋化工有限公司）;暗箱式紫外分析仪（上海嘉鹏科技公司）;冷冻干燥机（美国Virtis公司）。
1.1.2 试剂。
乙酸乙酯（分析纯，天津大茂化学试剂厂）;乙腈（色谱纯，上海星可生化有限公司）;娃哈哈纯净水;工业甲醇、乙醇、石油醚均重蒸后使用;显色剂为10%硫酸乙醇溶液。
1.1.3 标准品。
1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）对照品，成都埃法生物科技有限公司，批号AF20030702，含量98.61%。
1.1.4 试验材料。
该研究白及、黄花白及和小白及样品均于2019年10月采自云南省农业科学院高山经济植物研究所试验基地，所有样品在试验基地栽培满3年。样品信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 薄层色谱。
精确称量粉碎后的白及属3个种样品粉末各1.0 g，置于50 mL三角瓶中，加20 mL甲醇溶液溶解，置于超声波振荡器中超声处理30 min，过滤，离心后补足损失的甲醇溶液，用毛细管吸取各供试液分别点在做好标记的同一薄层色谱硅胶板上，置于展开缸中。展开溶剂系统为石油醚∶乙酸乙酯=7∶3。展开后，取出，迅速吹干，重复2次。在紫外灯（254 nm）下检视观测紫外吸收情况，再喷洒10% 硫酸乙醇显色剂，用吹风机加热，直到斑点完全显现。
1.2.2 高效液相色谱。
1.2.2.1 样品的提取。
精确称量白及样品1-1（200 g）粉末（过2号筛），用400 mL 90%乙醇溶液超声提取30 min后过滤，反复提取3次后将所有濾液综合，除去溶剂后，用石油醚萃取，萃取后的滤液减压浓缩后，冷冻干燥，记为白及提取物1-1（90%部分）。精确称量黄花白及样品2-1（100 g）、小白及样品3-3（100 g）粉末（均过2号筛），用200 mL 90%乙醇溶液超声提取30 min后过滤，反复提取3次后将所有滤液综合，除去溶剂后，用石油醚萃取，萃取后的滤液减压浓缩后，冷冻干燥，分别记为黄花白及提取物2-1（90%部分）和小白及提取物3-3（90%部分）。
1.2.2.2 供试品溶液的制备。
精确称量冻干后的白及提取物1-1（90%部分）、黄花白及提取物2-1（90%部分）和小白及提取物3-3（90%部分）各1 mg于样品瓶中，用5 mL乙腈溶解，溶液摇匀后，通过0.45 μm微孔滤膜过滤溶液，取续滤液即得。
1.2.2.3 对照品溶液的制备。
精密称量1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militaeine）对照品1 mg置于5 mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容到刻度线，摇匀。
1.2.2.4 色谱条件。
参考文献[22]，试验将水设为流动相A，乙腈为流动相B，进样量5 μL，检测波长270 nm，色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C 18柱，流速1 mL/min，柱温30 ℃，以梯度浓度洗脱，从0～40 min用5%～95%的乙腈-水梯度洗脱。
2 结果与分析
2.1 薄层色谱
在薄层色谱中，选用的展开剂为石油醚/乙酸乙酯（7∶3），在展开时为了能让展开的效果更好，进行了二次展开，试验最终得到的薄层色谱图见图1。从图1可看出，薄层色谱图清晰，斑点分离效果好，相同成分的比移值（retention factor value）基本一致，其中1-1和1-2的斑点最清晰，显示其中的成分浓度高于其他样品提取物中的相应成分浓度，3-1的斑点最淡，显示其中的成分浓度低于其他样品提取物中的相应成分浓度。试验结果初步说明白及、黄花白及、小白及3个种的药材样品具有相似或相同的化学成分，但相应的化学成分含量有差别，白及样品1-1和1-2的含量比其他样品的高。
2.2 高效液相色谱
2.2.1 标准品谱图。
图2为标准品militarine的谱图，由图可知其保留时间为12.487 min，峰高98.771 53 mAU，占总峰（排除溶剂峰）面积的98.844 8%。
2.2.2 样品谱图。 将白及、黄花白及和小白及的图谱与对照品图谱对比后得出表2，3个样品的高效液相色谱图见图3。
从表2可以看出，白及中的militarine峰的保留时间为12.282 min，峰高380.713 35 mAU，占总峰面积的13.906 6%;黄花白及中的保留时间为12.297 min，峰高278.845 70 mAU，占总峰面积的8.904 9%;小白及在保留时间为11.113～13.090 min内militarine峰对应位置没有形成峰，即图谱中没有militarine峰出现，说明小白及不含militarine。将三者比较，可明显看出白及中militarine的峰最高且峰面積最大，黄花白及的militarine峰高次之，小白及没有出现militarine峰。
从图3可看出，白及、黄花白及、小白及三者在相同浓度条件下出峰不同，白及有30个峰，黄花白及有33个峰，小白及有8个峰。白及和黄花白及图谱出峰相似度较高，小白及图谱与两者差别大。将白及、黄花白及和小白及三者的溶剂峰排除后，白及的峰中相对含量较高的峰为militarine峰，保留时间为12.282 min，峰面积3 909.227 78，峰高380.713 35 mAU，占总峰面积的13.906 6%;黄花白及的峰中相对含量较高的是15号峰，保留时间为 15.808 min，峰面积7531.761 72，峰高539.501 22 mAU，占总峰面积的26.410 5%;小白及的峰中相对含量较高的是1号峰，保留时间为11.113 min，峰面积525.329 59，峰高7.359 39 mAU，占总峰面积的29.920 0%。虽然在相同浓度条件下，白及、黄花白及和小白及都出峰了，可是在相同提取条件下、相同样品配制浓度，小白及提取物的浓度明显低于白及和黄花白及，小白及中的组分峰高最高为7.359 39 mAU，之后峰高逐渐降低，峰面积百分比也在降低，峰越往后越低，最后几乎与基线相重。
3 讨论与结论
白及的薄层色谱中，2015版《中华人民共和国药典》上的展开剂体系为环己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1），当室内温度较高时，容易引起溶剂的挥发，比例会发生变化，从而影响薄层的展开，与文献[23]中所述一致，在试验过程中对其进行改良，试验多次后选择石油醚-乙酸乙酯来展开，比例从9∶1、8∶2 调试到7∶3，发现7∶3的比例较好，展开所需时间也短。
试验中选择提取样品的溶剂为甲醇，同时参照文献[24]还用70%乙醇进行了对比，由于白及属植物中含有白及多糖成分，发现用含有较多水分的溶剂制备供试品，后期溶液的黏度很大，难于过滤，而用甲醇作溶剂来制备供试品溶液就不存在此问题。
在该薄层色谱试验中，选用展开剂为石油醚/乙酸乙酯（7∶3），在展开时为了能让展开的效果更好，进行了二次展开，试验最终得到的薄层色谱图清晰，斑点分离效果好，相同成分的比移值（retention factor value）基本一致，显示颜色也相同，初步说明白及、黄花白及、小白及药材样品具有相似或相同的化学成分，与文献[25]中薄层色谱分析结果一致。试验中提取物1-1和1-2的薄层色谱图中的斑点更清晰明显，显示其中的成分浓度高于其他几个提取物中的相应成分浓度，即试验中白及样品的有效成分含量高于黄花白及和小白及。作为一味中药，其中药效成分的含量是至关重要的指标，这一试验结果为《中华人民共和国药典》仅将白及作为白及药材唯一基源植物提供了一定的理论依据。
高效液相色谱试验白及属3个种样品选择的是梯度浓度洗脱，在梯度洗脱时，选择了很多浓度，最终选择经过优化后的3个浓度梯度进行试验。在此浓度条件下，得到3个样品的高效液相色谱图。其中白及样品militarine物质含量的吸收峰高于黄花白及的吸收峰，说明试验中白及中的militarine成分含量高于黄花白及。结果显示白及和黄花白及药材样品具有相似或相同的化学成分，结果与文献[24]一致，为黄花白及纳入四川和甘肃地方药材标准提供了一定的理论依据[26-27]，但两者具体成分含量差别较大;试验中小白及图谱中没有出现militarine峰，说明小白及中不含militarine成分，这一试验结果为白及和黄花白及等同药用提供了一定的理论依据，但白及、黄花白及、小白及三者的质量等同性、药效性及安全性还需进一步的深入研究。
参考文献
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关键词 白及属;化学成分;薄层色谱;高效液相色谱;分类鉴别
中图分类号 R 284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）19-0173-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.045
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Analysis of Chemical Constituents of Three Species Plants of Bletilla Reichb.f.
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Abstract [Objective]To establish the characteristic chromatograms of the chemical constituents of Bletilla striata， Bletilla ochracea and Bletilla formosana ， and in order to find a method to classify and identify Bletilla Reichb.f.[Method]TLC and HPLC were used to study the chromatograph of the chemical constituents of B. striata， B. ochracea and B.formosanar ， militaine was used as a standard product to compare and analyze the chemical composition of the three.[Result]TLC showed that three species had similar or identical chemical components， but the content in B.ochracea and B.formosanar was less than in B. striata .HPLC showed that militaeine chemical components were the highest in B. striata and the second in B.ochracea， but not detected in B. formosanar by HPLC.[Conclusion]The chemical constituents of three species are similar， which can provide reference for their equivalent medical use to some extent. The difference of the chemical components contents of three species provides a scientific basis for B. striata as the only original plant for the authentic traditional Chinese medicine.
Key words Bletilla Reichb.f;Chemical components;TLC;HPLC;Classified identification
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白及属（ Bletilla Reichb.f.）植物中国有4种，分别为白及[ Bletilla striata （Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.]、黄花白及（ Bletilla ochracea Schltr.）、小白及[ Bletilla formosana （Hayata）Schltr.]和华白及[ Bletilla sinensis （Rolfe）Schltr.][1]。该属植物不仅具有较高的观赏价值，也是我国重要的中药材，开发利用价值巨大。中药材白及为白及植物的干燥假鳞茎，具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咳血、溃疡病出血[2]。现代药理研究表明，白及药用功能广泛，药用价值高，具有止血、抗菌、抗炎镇痛、抗胃溃疡、抗肿瘤、抗硅肺、促进创面愈合、增强免疫力、保护消化道黏膜、促进血管内皮细胞生长及保护肝损伤等药理作用[3-12];白及多糖除了具有良好的药理活性外，同时还表现出良好的生物可降解性、生物相容性以及结构可修饰性，是应用前景广阔的生物材料，在传统药用剂型中用作栓塞剂基质、水凝胶基质、医用敷料材料、成膜材料，也在靶向给药系统以及生物组织工程等方面表现出了良好的应用空间和应用前景[13-15]。白及多糖还作为保湿美白剂应用于化妆品工业[16-17]。 云南省是白及属植物的主要分布区及主要药材产区之一[18]，4 种白及属植物中，小白及广泛分布于云南大部分地区;黄花白及主要分布于滇中地区和滇西北地区;华白及为云南特有，模式标本采自云南蒙自，现野生资源已极度濒危;在《中国植物志》[1]和《云南植物志》[19]及有关文献[20]记载云南境内并无白及这个种的自然分布，但有研究显示云南省是珍稀药用植物白及的潜在最适分布区[21]。在云南，黄花白及、小白及一直作为白及的地方习用品或代用品使用，但作为传统中药材仅白及一种列入《中华人民共和国药典》作为中药材白及的唯一基源植物[2]。这些地方习用品的等效性、合理合法性亟待进行综合评价及评估。该研究对白及、黄花白及、小白及进行化学成分的色谱图分析，了解主要活性成分方面的种间特征及差异，寻找能够分类鉴别白及属植物的特征，为云南白及属资源开发利用及白及属植物药用通用的合理性、有效性及安全性研究提供新的思路与科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与设备。1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（梯度泵、柱温箱、多波长紫外检测器、自动进样器，安捷伦科技有限公司）;Zorbax SB-C 18色谱柱（100 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司）;N-1300V-WB旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）;SB-1300调温水浴锅（东京理化器械株式会社）;超声波振荡器（日本精机制作所）;电子天平（梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）;GF254薄层色谱硅胶板（青岛海洋化工有限公司）;暗箱式紫外分析仪（上海嘉鹏科技公司）;冷冻干燥机（美国Virtis公司）。
1.1.2 试剂。
乙酸乙酯（分析纯，天津大茂化学试剂厂）;乙腈（色谱纯，上海星可生化有限公司）;娃哈哈纯净水;工业甲醇、乙醇、石油醚均重蒸后使用;显色剂为10%硫酸乙醇溶液。
1.1.3 标准品。
1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）对照品，成都埃法生物科技有限公司，批号AF20030702，含量98.61%。
1.1.4 试验材料。
该研究白及、黄花白及和小白及样品均于2019年10月采自云南省农业科学院高山经济植物研究所试验基地，所有样品在试验基地栽培满3年。样品信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 薄层色谱。
精确称量粉碎后的白及属3个种样品粉末各1.0 g，置于50 mL三角瓶中，加20 mL甲醇溶液溶解，置于超声波振荡器中超声处理30 min，过滤，离心后补足损失的甲醇溶液，用毛细管吸取各供试液分别点在做好标记的同一薄层色谱硅胶板上，置于展开缸中。展开溶剂系统为石油醚∶乙酸乙酯=7∶3。展开后，取出，迅速吹干，重复2次。在紫外灯（254 nm）下检视观测紫外吸收情况，再喷洒10% 硫酸乙醇显色剂，用吹风机加热，直到斑点完全显现。
1.2.2 高效液相色谱。
1.2.2.1 样品的提取。
精确称量白及样品1-1（200 g）粉末（过2号筛），用400 mL 90%乙醇溶液超声提取30 min后过滤，反复提取3次后将所有濾液综合，除去溶剂后，用石油醚萃取，萃取后的滤液减压浓缩后，冷冻干燥，记为白及提取物1-1（90%部分）。精确称量黄花白及样品2-1（100 g）、小白及样品3-3（100 g）粉末（均过2号筛），用200 mL 90%乙醇溶液超声提取30 min后过滤，反复提取3次后将所有滤液综合，除去溶剂后，用石油醚萃取，萃取后的滤液减压浓缩后，冷冻干燥，分别记为黄花白及提取物2-1（90%部分）和小白及提取物3-3（90%部分）。
1.2.2.2 供试品溶液的制备。
精确称量冻干后的白及提取物1-1（90%部分）、黄花白及提取物2-1（90%部分）和小白及提取物3-3（90%部分）各1 mg于样品瓶中，用5 mL乙腈溶解，溶液摇匀后，通过0.45 μm微孔滤膜过滤溶液，取续滤液即得。
1.2.2.3 对照品溶液的制备。
精密称量1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militaeine）对照品1 mg置于5 mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容到刻度线，摇匀。
1.2.2.4 色谱条件。
参考文献[22]，试验将水设为流动相A，乙腈为流动相B，进样量5 μL，检测波长270 nm，色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C 18柱，流速1 mL/min，柱温30 ℃，以梯度浓度洗脱，从0～40 min用5%～95%的乙腈-水梯度洗脱。
2 结果与分析
2.1 薄层色谱
在薄层色谱中，选用的展开剂为石油醚/乙酸乙酯（7∶3），在展开时为了能让展开的效果更好，进行了二次展开，试验最终得到的薄层色谱图见图1。从图1可看出，薄层色谱图清晰，斑点分离效果好，相同成分的比移值（retention factor value）基本一致，其中1-1和1-2的斑点最清晰，显示其中的成分浓度高于其他样品提取物中的相应成分浓度，3-1的斑点最淡，显示其中的成分浓度低于其他样品提取物中的相应成分浓度。试验结果初步说明白及、黄花白及、小白及3个种的药材样品具有相似或相同的化学成分，但相应的化学成分含量有差别，白及样品1-1和1-2的含量比其他样品的高。
2.2 高效液相色谱
2.2.1 标准品谱图。
图2为标准品militarine的谱图，由图可知其保留时间为12.487 min，峰高98.771 53 mAU，占总峰（排除溶剂峰）面积的98.844 8%。
2.2.2 样品谱图。 将白及、黄花白及和小白及的图谱与对照品图谱对比后得出表2，3个样品的高效液相色谱图见图3。
从表2可以看出，白及中的militarine峰的保留时间为12.282 min，峰高380.713 35 mAU，占总峰面积的13.906 6%;黄花白及中的保留时间为12.297 min，峰高278.845 70 mAU，占总峰面积的8.904 9%;小白及在保留时间为11.113～13.090 min内militarine峰对应位置没有形成峰，即图谱中没有militarine峰出现，说明小白及不含militarine。将三者比较，可明显看出白及中militarine的峰最高且峰面積最大，黄花白及的militarine峰高次之，小白及没有出现militarine峰。
从图3可看出，白及、黄花白及、小白及三者在相同浓度条件下出峰不同，白及有30个峰，黄花白及有33个峰，小白及有8个峰。白及和黄花白及图谱出峰相似度较高，小白及图谱与两者差别大。将白及、黄花白及和小白及三者的溶剂峰排除后，白及的峰中相对含量较高的峰为militarine峰，保留时间为12.282 min，峰面积3 909.227 78，峰高380.713 35 mAU，占总峰面积的13.906 6%;黄花白及的峰中相对含量较高的是15号峰，保留时间为 15.808 min，峰面积7531.761 72，峰高539.501 22 mAU，占总峰面积的26.410 5%;小白及的峰中相对含量较高的是1号峰，保留时间为11.113 min，峰面积525.329 59，峰高7.359 39 mAU，占总峰面积的29.920 0%。虽然在相同浓度条件下，白及、黄花白及和小白及都出峰了，可是在相同提取条件下、相同样品配制浓度，小白及提取物的浓度明显低于白及和黄花白及，小白及中的组分峰高最高为7.359 39 mAU，之后峰高逐渐降低，峰面积百分比也在降低，峰越往后越低，最后几乎与基线相重。
3 讨论与结论
白及的薄层色谱中，2015版《中华人民共和国药典》上的展开剂体系为环己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1），当室内温度较高时，容易引起溶剂的挥发，比例会发生变化，从而影响薄层的展开，与文献[23]中所述一致，在试验过程中对其进行改良，试验多次后选择石油醚-乙酸乙酯来展开，比例从9∶1、8∶2 调试到7∶3，发现7∶3的比例较好，展开所需时间也短。
试验中选择提取样品的溶剂为甲醇，同时参照文献[24]还用70%乙醇进行了对比，由于白及属植物中含有白及多糖成分，发现用含有较多水分的溶剂制备供试品，后期溶液的黏度很大，难于过滤，而用甲醇作溶剂来制备供试品溶液就不存在此问题。
在该薄层色谱试验中，选用展开剂为石油醚/乙酸乙酯（7∶3），在展开时为了能让展开的效果更好，进行了二次展开，试验最终得到的薄层色谱图清晰，斑点分离效果好，相同成分的比移值（retention factor value）基本一致，显示颜色也相同，初步说明白及、黄花白及、小白及药材样品具有相似或相同的化学成分，与文献[25]中薄层色谱分析结果一致。试验中提取物1-1和1-2的薄层色谱图中的斑点更清晰明显，显示其中的成分浓度高于其他几个提取物中的相应成分浓度，即试验中白及样品的有效成分含量高于黄花白及和小白及。作为一味中药，其中药效成分的含量是至关重要的指标，这一试验结果为《中华人民共和国药典》仅将白及作为白及药材唯一基源植物提供了一定的理论依据。
高效液相色谱试验白及属3个种样品选择的是梯度浓度洗脱，在梯度洗脱时，选择了很多浓度，最终选择经过优化后的3个浓度梯度进行试验。在此浓度条件下，得到3个样品的高效液相色谱图。其中白及样品militarine物质含量的吸收峰高于黄花白及的吸收峰，说明试验中白及中的militarine成分含量高于黄花白及。结果显示白及和黄花白及药材样品具有相似或相同的化学成分，结果与文献[24]一致，为黄花白及纳入四川和甘肃地方药材标准提供了一定的理论依据[26-27]，但两者具体成分含量差别较大;试验中小白及图谱中没有出现militarine峰，说明小白及中不含militarine成分，这一试验结果为白及和黄花白及等同药用提供了一定的理论依据，但白及、黄花白及、小白及三者的质量等同性、药效性及安全性还需进一步的深入研究。
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