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摘要：“叶绿体中色素的提取和分离”是必修一“光合作用” 内容中一个非常重要的实验，也是高考常考考点。 通过实验有助于学生掌握叶绿体中色素的种类和含量，进而加深对光合作用的理解。 教材虽然设计了详细的实验方案，但学生按照教材的要求操作，不仅束缚了学生的思维，而且实验成功率不高，导致对知识的掌握欠佳。 笔者通过查阅大量资料，与学生多次尝试，对实验进行改进，取得了较好的实验效果。
关键词：叶绿体色素提取实验；实验材料；实验方法
中图分类号：C35文献标识码： A
一、叶绿素简介
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。
二、实验原理
1、叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。
2、薄层色谱
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
三、对实验材料、操作步骤的改进
1、材料的处理
用泛黄的菠菜叶做对照。教材中所用的实验材料是新鲜的菠菜叶， 但第一天购买的菠菜到第三天部分就已经泛黄， 而一般全年级分班实验需要持续 3 d，丢弃泛黄的菠菜叶会造成浪费， 有学生质疑泛黄的菠菜叶中的色素和新鲜菠菜叶中的相同吗？ 因此，可以用泛黄的菠菜叶进行实验，与新鲜的菠菜形成对照，使学生体会各种色素的含量在植物体的不同阶段是有差异的。
2、提取色素方法改进
用沸水浴酒精溶解色素。教材要求在 5 g 菠菜叶中加 10 mL 无水乙醇和少许二氧化硅、碳酸钙研磨。 实际上，二氧化硅和碳酸钙的用量不好把握，多了，不仅难以过滤，而且会残留在滤液中，导致滤液杂质多；少了，研磨不充分，色素含量少，实验效果差。 另外，迅速、充分研磨的程度难以把握，叶和无水乙醇用量太大，而实际利用的色素量非常少，从而造成实验材料的浪费。为了提高色素提取的效果， 笔者采用沸水溶解色素法：将叶片剪碎，称取 2 g 装入试管，倒入 4 mL无水乙醇，将试管放入烧杯 60 ℃水浴中加热，约 5 min后色素几乎全部溶于无水乙醇， 用尼龙布过滤掉菠菜叶即得色素提取液。 该方法节约时间、环保，色素提取液量多杂质少。
3、画滤液细线的改进
盖玻片法。用教材所述方法划滤液细线不是太粗就是不齐， 甚至有学生用力过大而折断毛细吸管的现象出现，从而造成色素在两边堆积而中间较少，直接影响实验效果。 选用盖玻片法：用两个盖玻片并拢蘸取滤液划线，干燥后，再划两次，若划线次数太少，则滤纸条上色素较少，层析出的色素带颜色较浅；而超过3次，由于色素过多，往往会使层析出的色素带混在一起，尤其是叶绿素 a 和叶绿素 b。 用盖玻片画线 3次，操作简单，所划滤液细线细、齐，分离效果好。
4、对分离绿叶中色素的改进：圆形滤纸层析法。
教材采用滤纸条划滤液细线分离色素。 为了激发学生的创新思维， 笔者同时使用改进的条形滤纸层析法和圆形滤纸层析法。
（1） 条形滤纸层析法。
制备滤纸条：如图 1 所示，长度高出装层析液的小烧杯 1 cm，并将长出的部分做直角折叠，另一端剪去两角，用铅笔画线，将滤纸条用盖玻片法划滤液细线共 3次。另取一滤纸条不划滤液细线，其他处理相同，做空白对照。在培养皿盖的内面贴上双面胶，将滤纸条的折叠部分贴在双面胶上进行层析。
图 1条形滤纸层析法装置示意图
（2） 圆形滤纸层析法。
如图 2 所示，将干燥的圆形定性滤纸（直径 15 cm）盖在培养皿上，用毛细吸管吸取色素提取液在中央点样 3 次，形成圆形色素斑。 取细棉线一根，穿上缝衣针，在末端打个结，将针从滤纸的正面穿过色素斑中心，使结固定在濾纸正面，剪断棉线，使剩余棉线打结后的长度与培养皿等高。 另取一圆形滤纸不点样，其他操作相同，做空白对照。向培养皿（直径为 12 cm）中加入适量的层析液，把滤纸扣在培养皿底的上面，将棉线的另一端浸没在层析液中。 10 min 后，可以观察到滤纸上出现色素同心圆。
图 2圆形滤纸层析法装置示意图
二、实验结果与实验结论
1. 实验结果展示。
（1） 新鲜菠菜叶用圆形滤纸层析法和条形滤纸层
析法的结果展示如图 3、图 4 所示（空白对照无色素带）。
图 3圆形滤纸层析法结果示意图 图 4条形滤纸层析法结果示意图
（2） 新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶用条形滤纸层析法结果展示如图 5、图 6 所示。
（3） 新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶用圆形滤纸层析法结果展示如图 7、图 8 所示。
图 5新鲜菠菜叶图 6泛黄菠菜叶
2.实验结论。
圆形滤纸层析法分离色素出现明显的 4 个环状色素带（图 3），从外到内依次为：橙黄色（胡萝卜素）、黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素 a）、黄绿色（叶绿素b）。 条形滤纸层析法出现 4 个色素带（图 4），从上到下依次为：橙黄色（胡萝卜素）、黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素 a）、黄绿色（叶绿素 b）。无论是圆形滤纸层析法还是条形滤纸层析法，新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶中同种色素的含量是有差异的，新鲜菠菜叶中叶绿素 a、叶绿素 b 明显高于泛黄菠菜叶，而泛黄菠菜叶中叶黄素含量明显增多，叶绿素 a、叶绿素 b 含量减少，这说明菠菜叶各种色素的含量在植物体的不同阶段是有差异的。
图 7新鲜菠菜叶图 8泛黄菠菜叶
三、实验反思
用泛黄的菠菜叶与新鲜的菠菜叶进行实验，不仅避免了以往丢弃泛黄菠菜叶所造成的浪费， 而且使学生体会到了菠菜叶在放置一段时间后不同色素含量所发生的变化， 同时培养学生勇于质疑和探索的精神。 部分学生怀疑不同色素带是层析液在滤纸上扩散后留下来的颜色， 因此设计空白对照实验进行对照， 从而排除不同色素带是层析液在滤纸上扩散留下来的颜色的干扰。 采用沸水浴酒精溶解色素，用盖玻片法画滤液细线，以及用圆形滤纸层析，可以使实验现象更加明显。
结束语
使用改进过的方法从菠菜中提取叶绿素，提取量有大幅度提高。通过对提取条件的筛选，以5g新鲜菠菜为研究对象，加入50目3g的石英砂，0.1g的碳酸钙，充分研磨，20mL工业乙醇室温浸泡1h，可以提取叶绿素0.682mg/g。此方法操作简单，设备要求较低，原料价廉易得，叶绿素提取率高，进行层析时现象更为明显，对研究性实验的教学有很好的参考应用价值。
参考文献
[1]张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导（第4版）[M].北京：高等教育出版社，2009（12）.
关键词：叶绿体色素提取实验；实验材料；实验方法
中图分类号：C35文献标识码： A
一、叶绿素简介
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。
二、实验原理
1、叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。
2、薄层色谱
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
三、对实验材料、操作步骤的改进
1、材料的处理
用泛黄的菠菜叶做对照。教材中所用的实验材料是新鲜的菠菜叶， 但第一天购买的菠菜到第三天部分就已经泛黄， 而一般全年级分班实验需要持续 3 d，丢弃泛黄的菠菜叶会造成浪费， 有学生质疑泛黄的菠菜叶中的色素和新鲜菠菜叶中的相同吗？ 因此，可以用泛黄的菠菜叶进行实验，与新鲜的菠菜形成对照，使学生体会各种色素的含量在植物体的不同阶段是有差异的。
2、提取色素方法改进
用沸水浴酒精溶解色素。教材要求在 5 g 菠菜叶中加 10 mL 无水乙醇和少许二氧化硅、碳酸钙研磨。 实际上，二氧化硅和碳酸钙的用量不好把握，多了，不仅难以过滤，而且会残留在滤液中，导致滤液杂质多；少了，研磨不充分，色素含量少，实验效果差。 另外，迅速、充分研磨的程度难以把握，叶和无水乙醇用量太大，而实际利用的色素量非常少，从而造成实验材料的浪费。为了提高色素提取的效果， 笔者采用沸水溶解色素法：将叶片剪碎，称取 2 g 装入试管，倒入 4 mL无水乙醇，将试管放入烧杯 60 ℃水浴中加热，约 5 min后色素几乎全部溶于无水乙醇， 用尼龙布过滤掉菠菜叶即得色素提取液。 该方法节约时间、环保，色素提取液量多杂质少。
3、画滤液细线的改进
盖玻片法。用教材所述方法划滤液细线不是太粗就是不齐， 甚至有学生用力过大而折断毛细吸管的现象出现，从而造成色素在两边堆积而中间较少，直接影响实验效果。 选用盖玻片法：用两个盖玻片并拢蘸取滤液划线，干燥后，再划两次，若划线次数太少，则滤纸条上色素较少，层析出的色素带颜色较浅；而超过3次，由于色素过多，往往会使层析出的色素带混在一起，尤其是叶绿素 a 和叶绿素 b。 用盖玻片画线 3次，操作简单，所划滤液细线细、齐，分离效果好。
4、对分离绿叶中色素的改进：圆形滤纸层析法。
教材采用滤纸条划滤液细线分离色素。 为了激发学生的创新思维， 笔者同时使用改进的条形滤纸层析法和圆形滤纸层析法。
（1） 条形滤纸层析法。
制备滤纸条：如图 1 所示，长度高出装层析液的小烧杯 1 cm，并将长出的部分做直角折叠，另一端剪去两角，用铅笔画线，将滤纸条用盖玻片法划滤液细线共 3次。另取一滤纸条不划滤液细线，其他处理相同，做空白对照。在培养皿盖的内面贴上双面胶，将滤纸条的折叠部分贴在双面胶上进行层析。
图 1条形滤纸层析法装置示意图
（2） 圆形滤纸层析法。
如图 2 所示，将干燥的圆形定性滤纸（直径 15 cm）盖在培养皿上，用毛细吸管吸取色素提取液在中央点样 3 次，形成圆形色素斑。 取细棉线一根，穿上缝衣针，在末端打个结，将针从滤纸的正面穿过色素斑中心，使结固定在濾纸正面，剪断棉线，使剩余棉线打结后的长度与培养皿等高。 另取一圆形滤纸不点样，其他操作相同，做空白对照。向培养皿（直径为 12 cm）中加入适量的层析液，把滤纸扣在培养皿底的上面，将棉线的另一端浸没在层析液中。 10 min 后，可以观察到滤纸上出现色素同心圆。
图 2圆形滤纸层析法装置示意图
二、实验结果与实验结论
1. 实验结果展示。
（1） 新鲜菠菜叶用圆形滤纸层析法和条形滤纸层
析法的结果展示如图 3、图 4 所示（空白对照无色素带）。
图 3圆形滤纸层析法结果示意图 图 4条形滤纸层析法结果示意图
（2） 新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶用条形滤纸层析法结果展示如图 5、图 6 所示。
（3） 新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶用圆形滤纸层析法结果展示如图 7、图 8 所示。
图 5新鲜菠菜叶图 6泛黄菠菜叶
2.实验结论。
圆形滤纸层析法分离色素出现明显的 4 个环状色素带（图 3），从外到内依次为：橙黄色（胡萝卜素）、黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素 a）、黄绿色（叶绿素b）。 条形滤纸层析法出现 4 个色素带（图 4），从上到下依次为：橙黄色（胡萝卜素）、黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素 a）、黄绿色（叶绿素 b）。无论是圆形滤纸层析法还是条形滤纸层析法，新鲜菠菜叶与泛黄菠菜叶中同种色素的含量是有差异的，新鲜菠菜叶中叶绿素 a、叶绿素 b 明显高于泛黄菠菜叶，而泛黄菠菜叶中叶黄素含量明显增多，叶绿素 a、叶绿素 b 含量减少，这说明菠菜叶各种色素的含量在植物体的不同阶段是有差异的。
图 7新鲜菠菜叶图 8泛黄菠菜叶
三、实验反思
用泛黄的菠菜叶与新鲜的菠菜叶进行实验，不仅避免了以往丢弃泛黄菠菜叶所造成的浪费， 而且使学生体会到了菠菜叶在放置一段时间后不同色素含量所发生的变化， 同时培养学生勇于质疑和探索的精神。 部分学生怀疑不同色素带是层析液在滤纸上扩散后留下来的颜色， 因此设计空白对照实验进行对照， 从而排除不同色素带是层析液在滤纸上扩散留下来的颜色的干扰。 采用沸水浴酒精溶解色素，用盖玻片法画滤液细线，以及用圆形滤纸层析，可以使实验现象更加明显。
结束语
使用改进过的方法从菠菜中提取叶绿素，提取量有大幅度提高。通过对提取条件的筛选，以5g新鲜菠菜为研究对象，加入50目3g的石英砂，0.1g的碳酸钙，充分研磨，20mL工业乙醇室温浸泡1h，可以提取叶绿素0.682mg/g。此方法操作简单，设备要求较低，原料价廉易得，叶绿素提取率高，进行层析时现象更为明显，对研究性实验的教学有很好的参考应用价值。
参考文献
[1]张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导（第4版）[M].北京：高等教育出版社，2009（12）.