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摘要：为开发一种新型降血糖肽，以牡丹籽蛋白为原料，探索使用生物酶法制备牡丹籽降血糖肽。以α-葡萄糖苷酶抑制活性为标准，使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶进行最佳酶类筛选，选择抑制活性最好的酶，然后使用单因素试验、响应面试验优化工艺条件。胰蛋白酶的抑制效果最好，响应面优化得到最优工艺条件：蛋白浓度为08%、加酶量为5 401.57 U/g、温度为37.62 ℃、时间为43.18 min、pH值=8.07。该条件下经过试验验证α-葡萄糖苷酶的实际抑制率达到22.21%，与预测值22.11%基本吻合，模型回归显著。该结论为牡丹籽降血糖肽进一步研究与生产提供基础，也为牡丹籽蛋白高效利用提供新方向。
关键词：牡丹籽蛋白；α-葡萄糖苷酶抑制率；酶解；响应面法；最优工艺条件
中图分类号： R284.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0167-04
牡丹油是我国新型的食用油，其中牡丹籽的含油率为29%[1]，粗蛋白含量约占20%，蛋白含量较为丰富。牡丹油营养价值高，需求量也越来越大。迄今为止，油料牡丹的种植面积已达2万hm2以上[2]。榨油后的牡丹籽粕多作为饲料，深层次的加工利用较少，如何高效利用牡丹籽蛋白是本领域亟待解决的问题[3]。
糖尿病是一种严重影响人们身体健康的疾病[4]。近年来，随着经济飞速发展，人们的饮食越来越好，运动却日趋减少，糖尿病的发病率逐年增加。传统的降血糖药分为葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、中成药、胰岛素、双胍类、磺酞脲类等7种药物类型[5-7]，由于药物治疗存在副作用，长期使用患者难以接受。近年来，通过食疗达到控制血糖的方法越来越受到人们的青睐，其中新开发的α-葡萄糖苷酶抑制物是专家学者的努力方向。
最新研究表明，蛋白质经过蛋白酶酶解之后所获得的生物活性物质多肽具有降血压、降血脂等功效[8]，杂色蛤、蚕丝、蛋清、乳清等蛋白经过酶解也表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以起到辅助降血糖作用[9-14]。以牡丹籽蛋白为酶解底物、酶解多肽对α-葡萄糖苷酶活性抑制率为评价指标，建立制备方法，并采用响应面法进行工艺优化，获得最佳酶解参数，为开发新型降血糖多肽提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
试验动物为昆明小鼠，购自江苏大学试验动物中心（合格证编号：20152299）。
试验材料与药品：牡丹籽购自安徽省亳州市谯城区万亩药材种植农民专业合作社；对硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷（pNPG）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；胰蛋白酶（质量比1 ∶250）、木瓜蛋白酶均购自国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶购自北京奥博星生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1牡丹籽蛋白的制备
牡丹籽经65 ℃烘干12 h，剥壳，65 ℃烘干8 h，榨油，将所得牡丹籽粕烘干粉碎，与蒸馏水按照料液比1 g ∶[KG-*3]10 mL混溶，1 mol/L NaOH调节pH值至 9.5，50 ℃超声水浴2 h，3 800 r/min离心15 min；所得沉淀重复提2次，合并所得溶液，4 mol/L盐酸调节pH值至4.5，4 000 r/min 离心15 min，弃上清；将所得沉淀55 ℃烘干，粉碎，过40目筛得到牡丹籽蛋白。
1.2.2α-葡萄糖苷酶制备
脱臼处死小鼠，取小肠浸泡于0 ℃生理盐水中，洗去杂物，液氮研磨。将研磨粉与pH值=6.8的0.05 mol/L磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，简称PBS）质量体积比1 mg ∶10 mL加入，涡旋振荡 30～60 s，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清。
1.2.3检测方法
酪氨酸标准曲线与酶活力的测定方法参照周景祥等的方法[15]；α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法参照Lee等的方法[14]。
1.2.4单因素条件的筛选与响应面试验设计
以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，通过单因素试验对加酶量、底物浓度、温度、时间、pH值等条件进行筛选。根据单因素试验结果，将加酶量、温度、时间、pH值作为响应面设计的响应值进行分析。
1.2.5数据分析
通过Design Expert 8.0.6软件建立响应面模型与分析数据。
2结果与分析
2.1酶类筛选的结果
分别选取猪胰蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行蛋白酶的筛选试验。反应体系为50 mL，时间为 3 h，底物浓度为2%，按照各自适宜pH值、温度进行反应。酶解反应容器放在恒温水浴锅内，间歇搅拌，加入1 mol/L NaOH溶液维持pH值稳定。反应结束后，沸水浴10 min灭酶，冷却之后8 000 r/min离心10 min，取上清液检测α-葡萄糖苷酶抑制率。
由表1可知，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解多肽产物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果较差，胰蛋白酶酶解產物抑制效果较好。这可能是因为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶切位点较为广泛导致产物多样，胰蛋白酶酶切位点较为特殊，酶切位点集中在精氨酸（arginine，简称Arg）、赖氨酸（lysine，简称Lys）为羧基端的肽键部分[16]，特殊序列能对α-葡萄糖苷酶分子产生抑制作用。因此，选择胰蛋白酶进行试验。
2.2单因素试验结果
2.2.1不同酶解时间对抑制率的影响
在不同时间点0、10、20、30、40、50、60、70 min，加酶量为5 000 U/g，底物浓度为0.8%，温度为37 ℃，pH值=8.0的条件下分别检测抑制效果。由图1可知，在0～40 min时抑制率不断上升，可能是因为胰蛋白酶将牡丹籽蛋白质切成具有抑制活性的多肽不断增多，在40 min时抑制率达到最高，继续延长反应时间，抑制率并未有明显增加，因此选择40 min作为最优时间。
关键词：牡丹籽蛋白；α-葡萄糖苷酶抑制率；酶解；响应面法；最优工艺条件
中图分类号： R284.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0167-04
牡丹油是我国新型的食用油，其中牡丹籽的含油率为29%[1]，粗蛋白含量约占20%，蛋白含量较为丰富。牡丹油营养价值高，需求量也越来越大。迄今为止，油料牡丹的种植面积已达2万hm2以上[2]。榨油后的牡丹籽粕多作为饲料，深层次的加工利用较少，如何高效利用牡丹籽蛋白是本领域亟待解决的问题[3]。
糖尿病是一种严重影响人们身体健康的疾病[4]。近年来，随着经济飞速发展，人们的饮食越来越好，运动却日趋减少，糖尿病的发病率逐年增加。传统的降血糖药分为葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、中成药、胰岛素、双胍类、磺酞脲类等7种药物类型[5-7]，由于药物治疗存在副作用，长期使用患者难以接受。近年来，通过食疗达到控制血糖的方法越来越受到人们的青睐，其中新开发的α-葡萄糖苷酶抑制物是专家学者的努力方向。
最新研究表明，蛋白质经过蛋白酶酶解之后所获得的生物活性物质多肽具有降血压、降血脂等功效[8]，杂色蛤、蚕丝、蛋清、乳清等蛋白经过酶解也表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以起到辅助降血糖作用[9-14]。以牡丹籽蛋白为酶解底物、酶解多肽对α-葡萄糖苷酶活性抑制率为评价指标，建立制备方法，并采用响应面法进行工艺优化，获得最佳酶解参数，为开发新型降血糖多肽提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
试验动物为昆明小鼠，购自江苏大学试验动物中心（合格证编号：20152299）。
试验材料与药品：牡丹籽购自安徽省亳州市谯城区万亩药材种植农民专业合作社；对硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷（pNPG）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；胰蛋白酶（质量比1 ∶250）、木瓜蛋白酶均购自国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶购自北京奥博星生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1牡丹籽蛋白的制备
牡丹籽经65 ℃烘干12 h，剥壳，65 ℃烘干8 h，榨油，将所得牡丹籽粕烘干粉碎，与蒸馏水按照料液比1 g ∶[KG-*3]10 mL混溶，1 mol/L NaOH调节pH值至 9.5，50 ℃超声水浴2 h，3 800 r/min离心15 min；所得沉淀重复提2次，合并所得溶液，4 mol/L盐酸调节pH值至4.5，4 000 r/min 离心15 min，弃上清；将所得沉淀55 ℃烘干，粉碎，过40目筛得到牡丹籽蛋白。
1.2.2α-葡萄糖苷酶制备
脱臼处死小鼠，取小肠浸泡于0 ℃生理盐水中，洗去杂物，液氮研磨。将研磨粉与pH值=6.8的0.05 mol/L磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，简称PBS）质量体积比1 mg ∶10 mL加入，涡旋振荡 30～60 s，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清。
1.2.3检测方法
酪氨酸标准曲线与酶活力的测定方法参照周景祥等的方法[15]；α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法参照Lee等的方法[14]。
1.2.4单因素条件的筛选与响应面试验设计
以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，通过单因素试验对加酶量、底物浓度、温度、时间、pH值等条件进行筛选。根据单因素试验结果，将加酶量、温度、时间、pH值作为响应面设计的响应值进行分析。
1.2.5数据分析
通过Design Expert 8.0.6软件建立响应面模型与分析数据。
2结果与分析
2.1酶类筛选的结果
分别选取猪胰蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行蛋白酶的筛选试验。反应体系为50 mL，时间为 3 h，底物浓度为2%，按照各自适宜pH值、温度进行反应。酶解反应容器放在恒温水浴锅内，间歇搅拌，加入1 mol/L NaOH溶液维持pH值稳定。反应结束后，沸水浴10 min灭酶，冷却之后8 000 r/min离心10 min，取上清液检测α-葡萄糖苷酶抑制率。
由表1可知，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解多肽产物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果较差，胰蛋白酶酶解產物抑制效果较好。这可能是因为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶切位点较为广泛导致产物多样，胰蛋白酶酶切位点较为特殊，酶切位点集中在精氨酸（arginine，简称Arg）、赖氨酸（lysine，简称Lys）为羧基端的肽键部分[16]，特殊序列能对α-葡萄糖苷酶分子产生抑制作用。因此，选择胰蛋白酶进行试验。
2.2单因素试验结果
2.2.1不同酶解时间对抑制率的影响
在不同时间点0、10、20、30、40、50、60、70 min，加酶量为5 000 U/g，底物浓度为0.8%，温度为37 ℃，pH值=8.0的条件下分别检测抑制效果。由图1可知，在0～40 min时抑制率不断上升，可能是因为胰蛋白酶将牡丹籽蛋白质切成具有抑制活性的多肽不断增多，在40 min时抑制率达到最高，继续延长反应时间，抑制率并未有明显增加，因此选择40 min作为最优时间。