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摘要：目的 探讨血通灵对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭转移作用机制。方法 Transwell侵袭实验检测不同浓度血通灵对细胞侵袭作用的影响，初步明确药物抗肿瘤转移的物质基础；应用明胶酶谱法检测血通灵对MDA-MB-231细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的影响；Western blot检测不同浓度血通灵干预后细胞中MMP-9蛋白表达的变化。结果 不同浓度血通灵均能显著抑制细胞分泌MMP-9能力、细胞侵袭能力和细胞内MMP-9蛋白表达，该抑制作用呈剂量依赖关系。结论 血通灵可能通过下调MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达而降低活性MMP-9的分泌，抑制细胞的侵袭能力。
关键词：血通灵；人乳腺癌细胞；侵袭作用；基质金属蛋白酶-9
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0067-03
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率已位居全球女性恶性肿瘤之首。侵袭和转移是恶性肿瘤最关键的生物学特性，是肿瘤细胞与宿主细胞相互作用并在多因子共同调控下的多步骤、多水平的复杂而精细的连锁过程。当原发肿瘤发生转移后，患者病死率大大提高。因此，肿瘤细胞侵袭转移是人类癌症彻底根治的一大重要障碍。中药复方以其靶点多、成分多、不良反应少等抗肿瘤特点，成为抗肿瘤药物研究的热点，中药复方可通过干预肿瘤细胞转移、诱导凋亡、调节机体免疫力、改善乳腺癌多药耐药性等方面发挥防治肿瘤的复发、转移，减轻手术及放化疗的毒副反应，改善生活质量等作用。中药复方血通灵具有活血化瘀、消肿散结、清热解毒、补肾滋阴等功效。本研究观察血通灵体外抗乳腺癌侵袭转移作用，探讨其作用机制，为该复方的进一步开发和利用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 细胞
人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞均为单层贴壁细胞，购于美国ATCC细胞库。
1.2 药物及制备
血通灵由丹参、菊花、刺五加、桂枝、杜仲、葛根、红花、山楂、甘草、决明子、当归共11味药按一定比例组成，大连韩滨保健品公司提供。药材经粉碎成细粉状，采用自动煎药机制成水煎液，经减压浓缩，喷雾干燥后得干浸膏粉备用。称取一定量溶于PBS中配制成30 mg/mL储备液，应用0.22 μm滤膜滤过后于-20 ℃冰箱保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
DMEM完全培养液，Hyclone公司；新生小牛血清，Hyclone公司）；胰蛋白酶，Hyclone公司；明胶，Sigma公司；人工重组基底膜材料、孔径8 μm滤膜，BD公司；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）鼠抗人单克隆一抗，Cell signaling公司。CO2保温箱，美国Forma scientific公司，型号31642/N；倒置显微镜，日本Olympus公司；凝胶成像分析系统，美国UVP公司，型号Imagestore7500。
2 实验方法
2.1 细胞培养与分组
选取MDA-MB-231细胞按1×105/孔的细胞数目接种于6孔板，分为5组，培养在含10%小牛血清的DMEM溶液中37 ℃、5%CO2温箱中培养。待细胞长满平板的80%～90%，加无血清DMEM溶液饥饿细胞12 h，将血通灵储备液用无血清DMEM分别稀释成5、10、20、30 μg/mL浓度的溶液给药。继续培养24 h。
2.2 细胞侵袭实验
将Transwell小室放置于24孔板中，将培养好的细胞以5×104/孔的细胞数目接种于Transwell小室的上室中，孵育培养至细胞贴壁。在上室加入血通灵药物剂量为（0、10、20、30 μg/mL）2 mL，下室中加入含10%小牛血清的DMEM培养液，孵育24 h。将反应后的Transwell从24孔板中取出，苏木红染色固定。血球计数板在倒置显微镜下观察3～5个视野，进行细胞计数，计算侵袭率[干预组染色细胞数÷空白对照组染色细胞数×100%]。
2.3 明胶酶谱实验
制备含0.1%明胶的10%Acry/Bis的分离胶，其上方加入5%浓缩胶。取上清液20 μL加入5 μL上样缓冲液混匀，置于4 ℃恒压180 V电泳75 min。电泳结束后，切去浓缩胶，将分离胶置于平皿中，加入2.5% Triton-X100 150 mL振荡反复清洗3次，每次20 min。将分离胶置于孵育缓冲液中，并置于37 ℃温箱孵育过夜。孵育完毕后倒出缓冲液，加入考马斯亮蓝染色30 min，至出现蓝背景下的清晰白色条带为止。凝胶成像分析系统成像目的条带。每组实验重复3次。
2.4 免疫印迹实验
应用细胞裂解液提取干预后的各组细胞的总蛋白，8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维膜上，10%脱脂奶粉封闭后分别加入抗内参GAPDH单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体，再与相应的二抗反应，用显影剂显影目的条带。凝胶成像分析系统成像目的条带。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 血通灵对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响
给药后MDA-MB-231细胞侵袭能力呈下降趋势，见图1。血通灵在10、20、30 μg/mL剂量时，Transwell小室中侵袭转移细胞数量显著降低，且呈剂量依赖关系。侵袭率统计分析表明，血通灵在10、20、30 μg/mL剂量干预细胞后，Transwell小室中侵袭转移细胞数量与空白细胞间差异有统计学意义（P<0.05），见图2。提示血通灵具有抑制MDA-MB-231细胞的侵袭作用。
4.2 血通灵对基质金属蛋白酶-9活性的影响 明胶酶谱实验检测细胞株MDA-MB-231分泌至培养液中的活性MMP-9量，见图3。在分子量92 kDa位置处可见蓝色背景下清晰的白色条带为活性形式的MMP-9。与空白细胞比较，DA-MB-231在不同浓度血通灵作用下MMP-9酶活性显著下降。可见，血通灵能够显著抑制MMP-9酶活性，该抑制作用成剂量依赖关系。
4.3 血通灵对人乳腺癌细胞基质金属蛋白酶-9蛋白表达的影响
Western blot检测细胞中MMP-9蛋白表达。随着给药剂量的增加，血通灵能显著抑制MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达量，该抑制作用呈剂量依赖关系，见图4。
5 讨论
基质金属蛋白酶（MMPs）也称为基质因子，是一组与锌有关的金属蛋白酶，其主要功能是降解和再塑造细胞外基质（ECM）。其中MMP-9是降解ECM的主要蛋白水解酶之一，在肿瘤血管生成早期过程尤为重要，与多种肿瘤侵袭和转移过程密切相关。有研究表明，在肺癌组织中 MMP-9的表达明显高于正常组织，且MMP-9表达阳性的细胞多位于组织标本边缘，说明其参与肿瘤向外侵袭、浸润的过程[1]；在具有侵袭性垂体腺瘤细胞中MMP-9的表达量明显高于非垂体腺瘤[2]；在乳腺癌发生发展过程中，乳腺癌上皮细胞中MMP-9出现高表达现象，同时，细胞侵袭和转移能力也明显增强[3-4]。
现代研究表明，补虚药能调补气血阴阳，能升高白细胞数目而增强机体免疫能力；清热药有解热、抗毒、抗炎和增强免疫等作用；活血化瘀药有抗凝、促纤溶、抑制肿瘤转移等作用，可增强抗肿瘤药物和机体的免疫活性细胞与肿瘤细胞的接触能力，从而提高药物的治疗效果[5]。此外，血通灵复方中所包含的单味中药如丹参、红花、葛根等含有异黄酮、木脂素等植物雌激素样化学成分。该类成分可通过与内源性雌激素竞争雌激素受体，抑制和减少内源性雌激素的产生，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移、增殖等，被认为是具有潜在治疗激素类相关疾病能力的生物活性成分[6-7]。
本研究中，Transwell细胞侵袭实验显示，中药复方血通灵干预后，人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力明显降低且呈剂量依赖关系，提示血通灵可能通过抑制乳腺癌细胞侵袭作用而发挥抗肿瘤作用。为探讨血通灵抑制MDA-MB-231细胞侵袭作用的分子机制，以参与乳腺癌侵袭和转移的关键酶之一MMP-9作为研究对象，采用明胶酶谱实验与Western blot分别检测血通灵干预后MDA-MB-231细胞分泌MMP-9量以及细胞内MMP-9蛋白表达量。实验结果显示，空白MDA-MB-231细胞分泌MMP-9量均高于药物干预细胞。予血通灵干预后，以上作用被明显抑制，且抑制作用呈剂量依赖关系。Western blot检测给药干预后MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白的表达量，显示出与明胶酶谱实验和细胞侵袭实验相一致的趋势，这一结果提示，血通灵抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力可能与下调细胞中MMP-9蛋白表达而降低MMP-9的分泌有关。但血通灵对MMP-9抑制作用相关信号通路的机制尚不明确，有待进一步研究。
参考文献：
[1] 陈杰，庞江琳，覃燕梅.5F对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞PTEN、MMP-9表达的影响[J].华中科技大学学报：医学版，2012，41（2）：147- 151.
[2] 郭凌川，郑玉双，惠国桢.垂体腺瘤细胞形态变化及Ⅺ-67、MMP-9蛋白表达与肿瘤侵袭性的临床病理研究[J].中华神经外科杂志，2013，29（5）：465-468.
[3] Xu D， McKee CM， Cao Y， et al. Matrix metalloproteinase-9 regulates tumor cell invasion through cleavage of protease nexin-1[J]. Cancer Res，2010，70（17）：6988-6998.
[4] Matrisian LM， Heppner KJ， Jensen RA， et al. Expression of most MMPs family numbers in breast cancer represents a tumor-induced host response[J]. Am J Pathol，1996，14（9）：273-283.
[5] 卢雯平，姜翠红.古方治疗乳腺癌的用药规律[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（3）：133-136.
[6] 余增丽，张立实，吴德生.植物雌激素对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J].营养学报，2002，24（4）：401-404.
[7] 赵丕文，牛建昭，王继峰，等.6种中药活性成分植物雌激素作用的比较研究[J].中国药学杂志，2007，42（24）：1852-1855.
（收稿日期：2014-06-06；编辑：华强）
关键词：血通灵；人乳腺癌细胞；侵袭作用；基质金属蛋白酶-9
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0067-03
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率已位居全球女性恶性肿瘤之首。侵袭和转移是恶性肿瘤最关键的生物学特性，是肿瘤细胞与宿主细胞相互作用并在多因子共同调控下的多步骤、多水平的复杂而精细的连锁过程。当原发肿瘤发生转移后，患者病死率大大提高。因此，肿瘤细胞侵袭转移是人类癌症彻底根治的一大重要障碍。中药复方以其靶点多、成分多、不良反应少等抗肿瘤特点，成为抗肿瘤药物研究的热点，中药复方可通过干预肿瘤细胞转移、诱导凋亡、调节机体免疫力、改善乳腺癌多药耐药性等方面发挥防治肿瘤的复发、转移，减轻手术及放化疗的毒副反应，改善生活质量等作用。中药复方血通灵具有活血化瘀、消肿散结、清热解毒、补肾滋阴等功效。本研究观察血通灵体外抗乳腺癌侵袭转移作用，探讨其作用机制，为该复方的进一步开发和利用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 细胞
人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞均为单层贴壁细胞，购于美国ATCC细胞库。
1.2 药物及制备
血通灵由丹参、菊花、刺五加、桂枝、杜仲、葛根、红花、山楂、甘草、决明子、当归共11味药按一定比例组成，大连韩滨保健品公司提供。药材经粉碎成细粉状，采用自动煎药机制成水煎液，经减压浓缩，喷雾干燥后得干浸膏粉备用。称取一定量溶于PBS中配制成30 mg/mL储备液，应用0.22 μm滤膜滤过后于-20 ℃冰箱保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
DMEM完全培养液，Hyclone公司；新生小牛血清，Hyclone公司）；胰蛋白酶，Hyclone公司；明胶，Sigma公司；人工重组基底膜材料、孔径8 μm滤膜，BD公司；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）鼠抗人单克隆一抗，Cell signaling公司。CO2保温箱，美国Forma scientific公司，型号31642/N；倒置显微镜，日本Olympus公司；凝胶成像分析系统，美国UVP公司，型号Imagestore7500。
2 实验方法
2.1 细胞培养与分组
选取MDA-MB-231细胞按1×105/孔的细胞数目接种于6孔板，分为5组，培养在含10%小牛血清的DMEM溶液中37 ℃、5%CO2温箱中培养。待细胞长满平板的80%～90%，加无血清DMEM溶液饥饿细胞12 h，将血通灵储备液用无血清DMEM分别稀释成5、10、20、30 μg/mL浓度的溶液给药。继续培养24 h。
2.2 细胞侵袭实验
将Transwell小室放置于24孔板中，将培养好的细胞以5×104/孔的细胞数目接种于Transwell小室的上室中，孵育培养至细胞贴壁。在上室加入血通灵药物剂量为（0、10、20、30 μg/mL）2 mL，下室中加入含10%小牛血清的DMEM培养液，孵育24 h。将反应后的Transwell从24孔板中取出，苏木红染色固定。血球计数板在倒置显微镜下观察3～5个视野，进行细胞计数，计算侵袭率[干预组染色细胞数÷空白对照组染色细胞数×100%]。
2.3 明胶酶谱实验
制备含0.1%明胶的10%Acry/Bis的分离胶，其上方加入5%浓缩胶。取上清液20 μL加入5 μL上样缓冲液混匀，置于4 ℃恒压180 V电泳75 min。电泳结束后，切去浓缩胶，将分离胶置于平皿中，加入2.5% Triton-X100 150 mL振荡反复清洗3次，每次20 min。将分离胶置于孵育缓冲液中，并置于37 ℃温箱孵育过夜。孵育完毕后倒出缓冲液，加入考马斯亮蓝染色30 min，至出现蓝背景下的清晰白色条带为止。凝胶成像分析系统成像目的条带。每组实验重复3次。
2.4 免疫印迹实验
应用细胞裂解液提取干预后的各组细胞的总蛋白，8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维膜上，10%脱脂奶粉封闭后分别加入抗内参GAPDH单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体，再与相应的二抗反应，用显影剂显影目的条带。凝胶成像分析系统成像目的条带。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 血通灵对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响
给药后MDA-MB-231细胞侵袭能力呈下降趋势，见图1。血通灵在10、20、30 μg/mL剂量时，Transwell小室中侵袭转移细胞数量显著降低，且呈剂量依赖关系。侵袭率统计分析表明，血通灵在10、20、30 μg/mL剂量干预细胞后，Transwell小室中侵袭转移细胞数量与空白细胞间差异有统计学意义（P<0.05），见图2。提示血通灵具有抑制MDA-MB-231细胞的侵袭作用。
4.2 血通灵对基质金属蛋白酶-9活性的影响 明胶酶谱实验检测细胞株MDA-MB-231分泌至培养液中的活性MMP-9量，见图3。在分子量92 kDa位置处可见蓝色背景下清晰的白色条带为活性形式的MMP-9。与空白细胞比较，DA-MB-231在不同浓度血通灵作用下MMP-9酶活性显著下降。可见，血通灵能够显著抑制MMP-9酶活性，该抑制作用成剂量依赖关系。
4.3 血通灵对人乳腺癌细胞基质金属蛋白酶-9蛋白表达的影响
Western blot检测细胞中MMP-9蛋白表达。随着给药剂量的增加，血通灵能显著抑制MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达量，该抑制作用呈剂量依赖关系，见图4。
5 讨论
基质金属蛋白酶（MMPs）也称为基质因子，是一组与锌有关的金属蛋白酶，其主要功能是降解和再塑造细胞外基质（ECM）。其中MMP-9是降解ECM的主要蛋白水解酶之一，在肿瘤血管生成早期过程尤为重要，与多种肿瘤侵袭和转移过程密切相关。有研究表明，在肺癌组织中 MMP-9的表达明显高于正常组织，且MMP-9表达阳性的细胞多位于组织标本边缘，说明其参与肿瘤向外侵袭、浸润的过程[1]；在具有侵袭性垂体腺瘤细胞中MMP-9的表达量明显高于非垂体腺瘤[2]；在乳腺癌发生发展过程中，乳腺癌上皮细胞中MMP-9出现高表达现象，同时，细胞侵袭和转移能力也明显增强[3-4]。
现代研究表明，补虚药能调补气血阴阳，能升高白细胞数目而增强机体免疫能力；清热药有解热、抗毒、抗炎和增强免疫等作用；活血化瘀药有抗凝、促纤溶、抑制肿瘤转移等作用，可增强抗肿瘤药物和机体的免疫活性细胞与肿瘤细胞的接触能力，从而提高药物的治疗效果[5]。此外，血通灵复方中所包含的单味中药如丹参、红花、葛根等含有异黄酮、木脂素等植物雌激素样化学成分。该类成分可通过与内源性雌激素竞争雌激素受体，抑制和减少内源性雌激素的产生，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移、增殖等，被认为是具有潜在治疗激素类相关疾病能力的生物活性成分[6-7]。
本研究中，Transwell细胞侵袭实验显示，中药复方血通灵干预后，人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力明显降低且呈剂量依赖关系，提示血通灵可能通过抑制乳腺癌细胞侵袭作用而发挥抗肿瘤作用。为探讨血通灵抑制MDA-MB-231细胞侵袭作用的分子机制，以参与乳腺癌侵袭和转移的关键酶之一MMP-9作为研究对象，采用明胶酶谱实验与Western blot分别检测血通灵干预后MDA-MB-231细胞分泌MMP-9量以及细胞内MMP-9蛋白表达量。实验结果显示，空白MDA-MB-231细胞分泌MMP-9量均高于药物干预细胞。予血通灵干预后，以上作用被明显抑制，且抑制作用呈剂量依赖关系。Western blot检测给药干预后MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白的表达量，显示出与明胶酶谱实验和细胞侵袭实验相一致的趋势，这一结果提示，血通灵抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力可能与下调细胞中MMP-9蛋白表达而降低MMP-9的分泌有关。但血通灵对MMP-9抑制作用相关信号通路的机制尚不明确，有待进一步研究。
参考文献：
[1] 陈杰，庞江琳，覃燕梅.5F对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞PTEN、MMP-9表达的影响[J].华中科技大学学报：医学版，2012，41（2）：147- 151.
[2] 郭凌川，郑玉双，惠国桢.垂体腺瘤细胞形态变化及Ⅺ-67、MMP-9蛋白表达与肿瘤侵袭性的临床病理研究[J].中华神经外科杂志，2013，29（5）：465-468.
[3] Xu D， McKee CM， Cao Y， et al. Matrix metalloproteinase-9 regulates tumor cell invasion through cleavage of protease nexin-1[J]. Cancer Res，2010，70（17）：6988-6998.
[4] Matrisian LM， Heppner KJ， Jensen RA， et al. Expression of most MMPs family numbers in breast cancer represents a tumor-induced host response[J]. Am J Pathol，1996，14（9）：273-283.
[5] 卢雯平，姜翠红.古方治疗乳腺癌的用药规律[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（3）：133-136.
[6] 余增丽，张立实，吴德生.植物雌激素对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J].营养学报，2002，24（4）：401-404.
[7] 赵丕文，牛建昭，王继峰，等.6种中药活性成分植物雌激素作用的比较研究[J].中国药学杂志，2007，42（24）：1852-1855.
（收稿日期：2014-06-06；编辑：华强）