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【摘要】目的 通过荧光定量RT-PCR方法检测2013年沈阳地区采集的327份手足口病病例的病原学特征，为手足口病的防治工作提供科学依据。方法收集2013年手足口病粪便标本321份、咽拭标本6份用荧光定量RT-PCR进行鉴定。结果2013年321份手足口病粪便标本经肠道病毒通用引物PCR检测279份为阳性，其中HEV-71占44.4%,CV-A16占25.8%，未分型的其他肠道病毒占29.7%。6份手足口病咽拭标本均为阴性。结论 沈阳地区2013年手足口病病原体优势型别均为HEV-71型。
【关键词】手足口病；肠道病毒属；病原学检测
【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）06-0352-01
手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。能引起HFMD的病毒很多，主要为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒、埃可病毒和新肠道病毒。其中，肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxAl6)是引起HFMD的最主要两种病原[1]，这两种病毒引起的HFMD临床症状很相似，难以区分，但由EV71引起的HFMD会进一步发展为脑炎，无菌性脑膜炎易引起中枢神经等系统的严重并发症[2]，病死率高，并会引起局部地区或更大范围的暴发。因此，对引起HFMD两种最主要病原EV71和CAl6进行迅速鉴别诊断显得尤为重要。本文通过对2013年沈阳地区321例手足口病病例进行病原和流行特征分析，为有效预防控制手足口病提供科学依据。
1材料与方法
1.1标本采集
收集2013年沈阳地区哨点医院送检的粪便及咽拭标本共327份（其中321份粪便标本,6份咽拭标本），检测327份标本的肠道通用病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型病毒核酸。
1.2检测方法
1.2.1病毒RNA提取
取采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit, 严格按照试剂盒操作说明书进行，提取的RNA立即进行实验或-80℃保存。
1.2.2荧光定量PCR
1.2.2.1待测标本的Real-time RT-PCR检测
使用中山大学达安基因股份有限公司生产的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒、肠道病毒71型核酸检测试剂盒和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒进行总肠道病毒、EV71和CoxA16检测。反应体系：RT-PCR反应液15μl、逆转录酶系2μl、Taq酶系3μl，模板RNA 5μl。反应条件：40℃，25min逆转录反应；94℃，3min变性；93℃，15sec，55℃，45sec，40个循环。应用ABI 7500荧光定量PCR仪进行反应。
1.2.2.2结果判断
阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值显示；阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30；表示实验有效。如果检测样品无典型S型扩增曲线或Ct值>35，判断样品为阴性；如果检测样品呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35，判断样品为阳性[3]。
2结果
2.1HFMD病例标本阳性率分析
2013年采用实时荧光定量RT-PCR检测，6份咽拭标本检测均为阴性，321份粪便标本中肠道病毒通用引物阳性率为86.9%(279/321)，见表1。
2.2 HFMD病例标本病原检测分析
在2013年采集的321份粪便标本中有279份为阳性，阳性率86.9%，其中HEV-71占44.4%(124/279),CV-A16占25.8%(72/279),其他肠道病毒占29.7%(83/279) 。对比2013年HFMD病例标本的病原检测结果可以看出，HEV-71为主要病原型别。
表1 2013年HFMD病例标本检测结果(n,%)
样本类型 采集标本数 阳性标本数 病原型别
HEV-71 CV-A16 其他肠道病毒
便 321 279(86.9) 124(44.4) 72(25.8) 83(29.7)
咽拭 6 0 0 0 0
3 讨论
手足口病是一种全球性的肠道传染性疾病，从1981年上海首次报道本病以来，在我国流行呈上升趋势，2008年5月2日手足口病被纳入我国丙类传染病管理。沈阳市从2008年开始监测手足口病，到2012年为止病原型别以HEV-71和CV-A16为主，其中优势型别均为HEV-71型[4]。2013年共采集了327份HFMD病例标本，包括321份粪便标本和6份咽拭标本，其中咽拭标本检测均为阴性，粪便标本阳性率为86.9%，主要型别仍然为HEV-71和CV-A16，优势型别为HEV-71型。同时，对比沈阳市近几年监测结果，其他肠道病毒所占比率逐年增加，2013年达到29.7%，说明除HEV-71型和CV-A16型外，引起手足口病暴发的其他肠道病毒同样需要关注[5]。
本文通过对沈阳市2013年监测哨点医院收集的HFMD病例粪便标本进行分子生物学检测，结果显示主要致病病毒仍为HEV-71型，同时HEV-71型也是引起手足口重症病例的主要毒株类型。手足口病易导致托幼机构聚集和暴发疫情的发生，托幼机构儿童应作为手足口病防控的重点人群。截至目前为止，手足口病还没有特效的疫苗来预防，因地制宜的采取一些综合性防制措施已是控制本病流行的当务之急。
参考文献：
[1] Chang LY, Lin TY, Huang YC, et a1.Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virusAl6 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic.1998.Pediatr Infect Dis J, 1999, 18: 1092-1096.
[2] Chang LY, Lin TY, Hsu KH, et a1.Clinical features and risk factors of pulmonary oedema after enterovirus-71-related hand, foot, and mouth disease.Lancet, 1999, 354: 1682-1686.
[3] 中华人民共和国卫生部.手足口病预防控制指南（2009版）.中华人民共和国卫生部.2009.
[4] Liu N, Dong X, Li X, et al.Etiology Study on Hand, Foot and Mouth Disease in Shenyang from 2009 to 2011[J].Chin J Med Lab Technol, 2012, 8(1):9-12.
[5] 李忠，张华宁，裴耀文。不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究。检验医学与临床。2009，6,：268-269.
【关键词】手足口病；肠道病毒属；病原学检测
【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）06-0352-01
手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。能引起HFMD的病毒很多，主要为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒、埃可病毒和新肠道病毒。其中，肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxAl6)是引起HFMD的最主要两种病原[1]，这两种病毒引起的HFMD临床症状很相似，难以区分，但由EV71引起的HFMD会进一步发展为脑炎，无菌性脑膜炎易引起中枢神经等系统的严重并发症[2]，病死率高，并会引起局部地区或更大范围的暴发。因此，对引起HFMD两种最主要病原EV71和CAl6进行迅速鉴别诊断显得尤为重要。本文通过对2013年沈阳地区321例手足口病病例进行病原和流行特征分析，为有效预防控制手足口病提供科学依据。
1材料与方法
1.1标本采集
收集2013年沈阳地区哨点医院送检的粪便及咽拭标本共327份（其中321份粪便标本,6份咽拭标本），检测327份标本的肠道通用病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型病毒核酸。
1.2检测方法
1.2.1病毒RNA提取
取采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit, 严格按照试剂盒操作说明书进行，提取的RNA立即进行实验或-80℃保存。
1.2.2荧光定量PCR
1.2.2.1待测标本的Real-time RT-PCR检测
使用中山大学达安基因股份有限公司生产的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒、肠道病毒71型核酸检测试剂盒和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒进行总肠道病毒、EV71和CoxA16检测。反应体系：RT-PCR反应液15μl、逆转录酶系2μl、Taq酶系3μl，模板RNA 5μl。反应条件：40℃，25min逆转录反应；94℃，3min变性；93℃，15sec，55℃，45sec，40个循环。应用ABI 7500荧光定量PCR仪进行反应。
1.2.2.2结果判断
阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值显示；阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30；表示实验有效。如果检测样品无典型S型扩增曲线或Ct值>35，判断样品为阴性；如果检测样品呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35，判断样品为阳性[3]。
2结果
2.1HFMD病例标本阳性率分析
2013年采用实时荧光定量RT-PCR检测，6份咽拭标本检测均为阴性，321份粪便标本中肠道病毒通用引物阳性率为86.9%(279/321)，见表1。
2.2 HFMD病例标本病原检测分析
在2013年采集的321份粪便标本中有279份为阳性，阳性率86.9%，其中HEV-71占44.4%(124/279),CV-A16占25.8%(72/279),其他肠道病毒占29.7%(83/279) 。对比2013年HFMD病例标本的病原检测结果可以看出，HEV-71为主要病原型别。
表1 2013年HFMD病例标本检测结果(n,%)
样本类型 采集标本数 阳性标本数 病原型别
HEV-71 CV-A16 其他肠道病毒
便 321 279(86.9) 124(44.4) 72(25.8) 83(29.7)
咽拭 6 0 0 0 0
3 讨论
手足口病是一种全球性的肠道传染性疾病，从1981年上海首次报道本病以来，在我国流行呈上升趋势，2008年5月2日手足口病被纳入我国丙类传染病管理。沈阳市从2008年开始监测手足口病，到2012年为止病原型别以HEV-71和CV-A16为主，其中优势型别均为HEV-71型[4]。2013年共采集了327份HFMD病例标本，包括321份粪便标本和6份咽拭标本，其中咽拭标本检测均为阴性，粪便标本阳性率为86.9%，主要型别仍然为HEV-71和CV-A16，优势型别为HEV-71型。同时，对比沈阳市近几年监测结果，其他肠道病毒所占比率逐年增加，2013年达到29.7%，说明除HEV-71型和CV-A16型外，引起手足口病暴发的其他肠道病毒同样需要关注[5]。
本文通过对沈阳市2013年监测哨点医院收集的HFMD病例粪便标本进行分子生物学检测，结果显示主要致病病毒仍为HEV-71型，同时HEV-71型也是引起手足口重症病例的主要毒株类型。手足口病易导致托幼机构聚集和暴发疫情的发生，托幼机构儿童应作为手足口病防控的重点人群。截至目前为止，手足口病还没有特效的疫苗来预防，因地制宜的采取一些综合性防制措施已是控制本病流行的当务之急。
参考文献：
[1] Chang LY, Lin TY, Huang YC, et a1.Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virusAl6 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic.1998.Pediatr Infect Dis J, 1999, 18: 1092-1096.
[2] Chang LY, Lin TY, Hsu KH, et a1.Clinical features and risk factors of pulmonary oedema after enterovirus-71-related hand, foot, and mouth disease.Lancet, 1999, 354: 1682-1686.
[3] 中华人民共和国卫生部.手足口病预防控制指南（2009版）.中华人民共和国卫生部.2009.
[4] Liu N, Dong X, Li X, et al.Etiology Study on Hand, Foot and Mouth Disease in Shenyang from 2009 to 2011[J].Chin J Med Lab Technol, 2012, 8(1):9-12.
[5] 李忠，张华宁，裴耀文。不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究。检验医学与临床。2009，6,：268-269.