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摘要：比较研究5种中华补血草黄酮类化合物——异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素的体外抗氧化和抗肿瘤活性。运用MTT试验，检测5种中华补血草黄酮类化合物对HepG2和Hela肿瘤细胞体外增殖的影响；运用DPPH自由基清除试验，检测中华补血草黄酮的体外抗氧化活性。研究结果可知，5种中华补血草黄酮类化合物均显示一定抗氧化和抗肿瘤活性，但其活性强弱存在差异。本试验条件下其抗肿瘤活性由强到弱的顺序为：木樨草素>槲皮素>异鼠李素、芹菜素>异槲皮苷；体外抗氧化能力由强到弱的顺序为：槲皮素>木樨草素>异鼠李素>芹菜素>异槲皮苷。结果表明，中华补血草黄酮类化合物木樨草素、槲皮素、异鼠李素、芹菜素等为中华补血草抗肿瘤作用的重要活性成分，抗肿瘤作用与其抗氧化活性有关。
关键词：中华补血草；黄酮；抗肿瘤；抗氧化
中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0297-03
收稿日期：2014-10-22
基金项目：国家自然科学基金（编号：81102817）；国家级大学生创新创业训练计划（编号：201210324004）；江苏省高等学校大学生实践创新训练计划（编号：2012JSSPITP2373）；江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室开放项目（编号：JLCBE10006）。
作者简介：董蒙蒙（1991—），女，江苏连云港人，主要从事植物药药理药化学习和研究。E-mail：1249050523@qq.com。
通信作者：汤新慧，博士，教授，主要从事植物药药理药化研究。Tel：（0515）88233191；E-mail：xinhuitang@sina.com。白丹花科补血草属植物中华补血草[Limonium sinense （Girard） Kuntze]，别称匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为多年生泌盐草本植物，喜生于盐渍化的低洼湿地上，主要分布于我国东北、华北、华东等滨海地区[1-2]。据记载，中华补血草各部位均可入药，有清热解毒、止血散瘀、祛风消炎、抗癌、抗衰老的功效。民间常用其根治疗肝癌，用叶治疗胃溃疡和胃癌，用花治疗宫颈癌及各种出血[3-4]。现代药理学研究发现，该植物具有抗氧化、护肝、抗病毒、抑制肿瘤细胞体外增殖等多种药理活性[5-11]。笔者研究显示，该植物根醇提物安全低毒，能增强机体免疫力，对抗化疗药物5-Fu的免疫抑制作用，且其本身也具有显著抗肿瘤活性[12-13]。
中华补血草化学成分十分丰富，含有鞣质、黄酮类、生物碱、多糖、萜类、脂肪族化合物、氨基酸、矿物质、维生素等[5，14-16]。特别是中华补血草总酚含量很高，占根提取物的55.55%，主要包括黄酮类、鞣质和酚酸等，其中黄酮类含量高达24.60%[8]，目前，已在中华补血草提取物中发现槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素、北美圣草素、高北美圣草素、杨梅树皮素及其苷类等20多种黄酮类化合物[15，17-18]。已有研究证实，黄酮类化合物具有广泛的生物活性和多种药理作用，如抗氧化、抗炎、抗诱变、抑制肿瘤形成与生长等。近年来，关于黄酮类化合物在肿瘤、心脑血管疾病等方面的应用研究已经比较深入，加上其低毒性的特点，已成为天然药物和功能性食品研发的热点之一。近期有学者研究发现，中华补血草总黄酮类化合物具有显著抑制肿瘤细胞体外增殖作用[19]，其同属植物二色补血草中分离得到的黄酮类化合物也具有显著抗肿瘤活性[20]，黄酮类化合物可能是该属植物抗肿瘤作用的活性成分。
本研究采用MTT（四甲基噻唑蓝）法，研究中华补血草中5种含量丰富的黄酮类化合物——异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素[15，18]对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用，并运用自由基清除试验比较其体外抗氧化活性，以期为中华补血草抗肿瘤作用的物质基础研究和该植物的进一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器Spectra Max190酶标仪，美国Molecular Devices公司生产；Thermo Form 311 型CO2培养箱，美国Thermo Scientific 公司生产；TS100 型倒置光学显微镜，日本Nikon 公司生产；R205B型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；MIS-3020全自动高压灭菌器，日本三洋电机公司生产。
1.1.2试剂MTT（四甲基噻唑蓝），德国Sigma公司生产；胎牛血清、胰蛋白酶，美国Hyclone公司产品；DMEM培养基，美国Gibco公司产品；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3细胞株人肝癌 HepG2细胞株、人宫颈癌Hela细胞株，均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组取处于对数生长期 、状态良好的HepG2或Hela细胞，加入适量胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制细胞悬液，计数，并将细胞密度调整至4.0×104个/mL。取细胞悬液接种于96孔板，100 μL/孔，置恒温CO2培养箱中，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。24 h后，将上述96孔板中的HepG2或Hela细胞分组，吸弃各孔内培养液，分别加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素，20 μmol/L 5-Fu（阳性对照），每组设4个平行孔，并设阴性对照组（细胞培养液）、空白组（DMEM细胞悬液），给药后继续培养。
1.2.2MTT试验按“1.2.1”节中方法在肿瘤细胞中加入5种中华补血草黄酮类化合物孵育48 h后，吸弃孔内培养液，加入无血清培养基100 μL，MTT（5.0 g/L） 20 μL/孔，37 ℃孵育4 h。吸弃孔内培养液，加入MTT（1 g/L），100 μL/孔，继续培养4 h，终止培养。吸弃孔内培养液，加入DMSO ，100 μL/孔，振荡使蓝紫色结晶物充分溶解，用空白组调零，置酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度（D570 nm），记录结果并计算样品的抑制率：抑制率=（1-D1/D0）×100%。式中：D1为供试样品的吸光度；D0为阴性对照的吸光度。 1.2.3DPPH自由基清除试验向96 孔板中分别加入 100 μL 含不同浓度异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素、维生素C（阳性对照）的甲醇溶液，再分别加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，各化合物实际终浓度分别为625、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L，混合均匀，室温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度，记为Di；同时测定不加DPPH 的样品空白吸光度（Dj） 和加DPPH 但不加样品（以样品溶解液替代）的吸光度（Dk）。自由基清除率计算公式如下：清除率=[1-（Di-Dj）/Dk]×100%。
1.2.4统计分析所有试验均进行3 次平行试验（n=3），使用SPSS 11. 0 统计软件进行数据分析，组间比较采用t检验，P<0. 05 为有统计学意义。
2结果与分析
2.1中华补血草5种黄酮类化合物对离体培养的HepG2 细胞增殖的影响
中华补血草黄酮类化合物对离体培养的HepG2 细胞增殖的影响见图1。5 种补血草黄酮类化合物中异鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素在6.25～100.00 μmol/L浓度范围内，对HepG2肿瘤细胞体外增殖均显示不同程度的抑制活性，抑制作用随着浓度的增高而增强，随着浓度升高至50 μmol/L时，化合物对肿瘤细胞增殖的抑制程度趋于平缓。对HepG2肿瘤细胞抑制活性由强到弱的顺序为：木樨草素>槲皮素>异鼠李素>芹菜素>异槲皮苷。其中100 μmol/L木樨草素、槲皮素、异鼠李素对HepG2细胞的增殖抑制作用与20 μmol/L 5-Fu（抑制率543%，图中未显示）没有明显差异。异槲皮苷对HepG2 细胞体外增殖的抑制作用较弱，100 μmol/L异槲皮苷的HepG2增殖抑制率仅为20.3%。
2.2中华补血草5种黄酮类化合物对离体培养的Hela 细胞增殖的影响
5种中华补血草黄酮类化合物作用48 h对Hela肿瘤细胞生长的抑制作用见图2。可见6.25～100.00 μmol/L异鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素可显著抑制Hela肿瘤细胞体外增殖活性，抑制作用亦随着浓度的增高而增强，100 μmol/L 4种化合物对Hela肿瘤细胞抑制活性由强到弱的顺序为：樨草素>槲皮素>异鼠李素>芹菜素。木樨草素和槲皮素对HepG2细胞的增殖抑制作用与20 μmol/L 5-Fu（抑制率402%）没有明显差异。6.25～100.00 μmol/L异槲皮苷对Hela肿瘤细胞体外增殖无明显影响。
2.3中华补血草5种黄酮类化合物对DPPH自由基的清除作用
5种化合物在6.25～200.00 μmol/L浓度范围内均具有良好的DPPH自由基清除活性，并随浓度的增加，清除作用增强（图3）。其中，槲皮素对DPPH自由基清除作用最强，200 μmol/L 槲皮素的DPPH自由基清除率最高，达87.3%，高于阳性对照维生素C组，5种黄酮化合物自由基清除活性强弱顺序为：槲皮素>木樨草素>异鼠李素>芹菜素>异槲皮苷。
3讨论与结论
黄酮类化合物，别称生物类黄酮，是以色酮环和苯环为基本结构的一类化合物的总称，为植物的次级代谢产物，广泛分布于自然界。目前已发现的黄酮类单体化合物达9 000多种，研究证明，黄酮类化合物具有多种生物活性。近年来研究发现，黄酮类化合物可通过提高抗氧化物酶的活性、清除自由基、诱导肿瘤细胞凋亡等多种渠道发挥抗肿瘤作用[21]，相关抗肿瘤活性引起了广泛关注。目前已有多个黄酮类化合物作为抗肿瘤药物进入临床。黄酮类化合物已成为今后新药开发研究中值得重视的资源，具有良好的开发利用前景。
中华补血草中黄酮类化合物含量丰富，已有研究显示，补血草属植物黄酮类化合物具有显著抗肿瘤活性，黄酮类化合物可能是中华补血草抗肿瘤作用的有效成分。本研究比较了中华补血草5种含量丰富的黄酮化合物——异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。MTT试验结果表明，中华补血草中5 种黄酮类化合物均具有一定的体外抗肿瘤活性，但活性强弱存在差异。木樨草素、槲皮素、异鼠李素抗肿瘤活性较强，芹菜素次之，而异槲皮苷对HepG2 细胞体外增殖显示较弱抑制作用，对Hela肿瘤细胞体外增殖则无明显影响。比较结构类似的2种化合物槲皮素与异槲皮苷发现，二者抗肿瘤活性存在明显差异，可能是因为分子中C3 位的羟基被糖基取代，而C2-C3 位双键是黄酮化合物抗肿瘤活性的一个关键因素，因此异槲皮苷抗肿瘤活性显著下降[22]。
为进一步明确中华补血草黄酮类化合物的抗肿瘤机制，本研究运用DPPH自由基清除试验，比较5种黄酮类化合物的体外抗氧化活性，发现5种化合物在本试验浓度范围内均具有良好的DPPH自由基清除活性，并随浓度的增加清除作用增强。其中槲皮素、木樨草素、异鼠李素抗氧化活性较强，异槲皮苷、芹菜素较弱。进一步研究发现，5种黄酮的抗肿瘤活性与抗氧化活性强弱比较接近，但并不完全一致，表明中华补血草黄酮类化合物抗氧化活性是其发挥抗肿瘤作用的重要因素，其他抗肿瘤机制还有待于进一步研究阐明。
参考文献：
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关键词：中华补血草；黄酮；抗肿瘤；抗氧化
中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0297-03
收稿日期：2014-10-22
基金项目：国家自然科学基金（编号：81102817）；国家级大学生创新创业训练计划（编号：201210324004）；江苏省高等学校大学生实践创新训练计划（编号：2012JSSPITP2373）；江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室开放项目（编号：JLCBE10006）。
作者简介：董蒙蒙（1991—），女，江苏连云港人，主要从事植物药药理药化学习和研究。E-mail：1249050523@qq.com。
通信作者：汤新慧，博士，教授，主要从事植物药药理药化研究。Tel：（0515）88233191；E-mail：xinhuitang@sina.com。白丹花科补血草属植物中华补血草[Limonium sinense （Girard） Kuntze]，别称匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为多年生泌盐草本植物，喜生于盐渍化的低洼湿地上，主要分布于我国东北、华北、华东等滨海地区[1-2]。据记载，中华补血草各部位均可入药，有清热解毒、止血散瘀、祛风消炎、抗癌、抗衰老的功效。民间常用其根治疗肝癌，用叶治疗胃溃疡和胃癌，用花治疗宫颈癌及各种出血[3-4]。现代药理学研究发现，该植物具有抗氧化、护肝、抗病毒、抑制肿瘤细胞体外增殖等多种药理活性[5-11]。笔者研究显示，该植物根醇提物安全低毒，能增强机体免疫力，对抗化疗药物5-Fu的免疫抑制作用，且其本身也具有显著抗肿瘤活性[12-13]。
中华补血草化学成分十分丰富，含有鞣质、黄酮类、生物碱、多糖、萜类、脂肪族化合物、氨基酸、矿物质、维生素等[5，14-16]。特别是中华补血草总酚含量很高，占根提取物的55.55%，主要包括黄酮类、鞣质和酚酸等，其中黄酮类含量高达24.60%[8]，目前，已在中华补血草提取物中发现槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素、北美圣草素、高北美圣草素、杨梅树皮素及其苷类等20多种黄酮类化合物[15，17-18]。已有研究证实，黄酮类化合物具有广泛的生物活性和多种药理作用，如抗氧化、抗炎、抗诱变、抑制肿瘤形成与生长等。近年来，关于黄酮类化合物在肿瘤、心脑血管疾病等方面的应用研究已经比较深入，加上其低毒性的特点，已成为天然药物和功能性食品研发的热点之一。近期有学者研究发现，中华补血草总黄酮类化合物具有显著抑制肿瘤细胞体外增殖作用[19]，其同属植物二色补血草中分离得到的黄酮类化合物也具有显著抗肿瘤活性[20]，黄酮类化合物可能是该属植物抗肿瘤作用的活性成分。
本研究采用MTT（四甲基噻唑蓝）法，研究中华补血草中5种含量丰富的黄酮类化合物——异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素[15，18]对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用，并运用自由基清除试验比较其体外抗氧化活性，以期为中华补血草抗肿瘤作用的物质基础研究和该植物的进一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器Spectra Max190酶标仪，美国Molecular Devices公司生产；Thermo Form 311 型CO2培养箱，美国Thermo Scientific 公司生产；TS100 型倒置光学显微镜，日本Nikon 公司生产；R205B型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；MIS-3020全自动高压灭菌器，日本三洋电机公司生产。
1.1.2试剂MTT（四甲基噻唑蓝），德国Sigma公司生产；胎牛血清、胰蛋白酶，美国Hyclone公司产品；DMEM培养基，美国Gibco公司产品；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3细胞株人肝癌 HepG2细胞株、人宫颈癌Hela细胞株，均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组取处于对数生长期 、状态良好的HepG2或Hela细胞，加入适量胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制细胞悬液，计数，并将细胞密度调整至4.0×104个/mL。取细胞悬液接种于96孔板，100 μL/孔，置恒温CO2培养箱中，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。24 h后，将上述96孔板中的HepG2或Hela细胞分组，吸弃各孔内培养液，分别加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素，20 μmol/L 5-Fu（阳性对照），每组设4个平行孔，并设阴性对照组（细胞培养液）、空白组（DMEM细胞悬液），给药后继续培养。
1.2.2MTT试验按“1.2.1”节中方法在肿瘤细胞中加入5种中华补血草黄酮类化合物孵育48 h后，吸弃孔内培养液，加入无血清培养基100 μL，MTT（5.0 g/L） 20 μL/孔，37 ℃孵育4 h。吸弃孔内培养液，加入MTT（1 g/L），100 μL/孔，继续培养4 h，终止培养。吸弃孔内培养液，加入DMSO ，100 μL/孔，振荡使蓝紫色结晶物充分溶解，用空白组调零，置酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度（D570 nm），记录结果并计算样品的抑制率：抑制率=（1-D1/D0）×100%。式中：D1为供试样品的吸光度；D0为阴性对照的吸光度。 1.2.3DPPH自由基清除试验向96 孔板中分别加入 100 μL 含不同浓度异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素、维生素C（阳性对照）的甲醇溶液，再分别加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，各化合物实际终浓度分别为625、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L，混合均匀，室温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度，记为Di；同时测定不加DPPH 的样品空白吸光度（Dj） 和加DPPH 但不加样品（以样品溶解液替代）的吸光度（Dk）。自由基清除率计算公式如下：清除率=[1-（Di-Dj）/Dk]×100%。
1.2.4统计分析所有试验均进行3 次平行试验（n=3），使用SPSS 11. 0 统计软件进行数据分析，组间比较采用t检验，P<0. 05 为有统计学意义。
2结果与分析
2.1中华补血草5种黄酮类化合物对离体培养的HepG2 细胞增殖的影响
中华补血草黄酮类化合物对离体培养的HepG2 细胞增殖的影响见图1。5 种补血草黄酮类化合物中异鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素在6.25～100.00 μmol/L浓度范围内，对HepG2肿瘤细胞体外增殖均显示不同程度的抑制活性，抑制作用随着浓度的增高而增强，随着浓度升高至50 μmol/L时，化合物对肿瘤细胞增殖的抑制程度趋于平缓。对HepG2肿瘤细胞抑制活性由强到弱的顺序为：木樨草素>槲皮素>异鼠李素>芹菜素>异槲皮苷。其中100 μmol/L木樨草素、槲皮素、异鼠李素对HepG2细胞的增殖抑制作用与20 μmol/L 5-Fu（抑制率543%，图中未显示）没有明显差异。异槲皮苷对HepG2 细胞体外增殖的抑制作用较弱，100 μmol/L异槲皮苷的HepG2增殖抑制率仅为20.3%。
2.2中华补血草5种黄酮类化合物对离体培养的Hela 细胞增殖的影响
5种中华补血草黄酮类化合物作用48 h对Hela肿瘤细胞生长的抑制作用见图2。可见6.25～100.00 μmol/L异鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素可显著抑制Hela肿瘤细胞体外增殖活性，抑制作用亦随着浓度的增高而增强，100 μmol/L 4种化合物对Hela肿瘤细胞抑制活性由强到弱的顺序为：樨草素>槲皮素>异鼠李素>芹菜素。木樨草素和槲皮素对HepG2细胞的增殖抑制作用与20 μmol/L 5-Fu（抑制率402%）没有明显差异。6.25～100.00 μmol/L异槲皮苷对Hela肿瘤细胞体外增殖无明显影响。
2.3中华补血草5种黄酮类化合物对DPPH自由基的清除作用
5种化合物在6.25～200.00 μmol/L浓度范围内均具有良好的DPPH自由基清除活性，并随浓度的增加，清除作用增强（图3）。其中，槲皮素对DPPH自由基清除作用最强，200 μmol/L 槲皮素的DPPH自由基清除率最高，达87.3%，高于阳性对照维生素C组，5种黄酮化合物自由基清除活性强弱顺序为：槲皮素>木樨草素>异鼠李素>芹菜素>异槲皮苷。
3讨论与结论
黄酮类化合物，别称生物类黄酮，是以色酮环和苯环为基本结构的一类化合物的总称，为植物的次级代谢产物，广泛分布于自然界。目前已发现的黄酮类单体化合物达9 000多种，研究证明，黄酮类化合物具有多种生物活性。近年来研究发现，黄酮类化合物可通过提高抗氧化物酶的活性、清除自由基、诱导肿瘤细胞凋亡等多种渠道发挥抗肿瘤作用[21]，相关抗肿瘤活性引起了广泛关注。目前已有多个黄酮类化合物作为抗肿瘤药物进入临床。黄酮类化合物已成为今后新药开发研究中值得重视的资源，具有良好的开发利用前景。
中华补血草中黄酮类化合物含量丰富，已有研究显示，补血草属植物黄酮类化合物具有显著抗肿瘤活性，黄酮类化合物可能是中华补血草抗肿瘤作用的有效成分。本研究比较了中华补血草5种含量丰富的黄酮化合物——异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。MTT试验结果表明，中华补血草中5 种黄酮类化合物均具有一定的体外抗肿瘤活性，但活性强弱存在差异。木樨草素、槲皮素、异鼠李素抗肿瘤活性较强，芹菜素次之，而异槲皮苷对HepG2 细胞体外增殖显示较弱抑制作用，对Hela肿瘤细胞体外增殖则无明显影响。比较结构类似的2种化合物槲皮素与异槲皮苷发现，二者抗肿瘤活性存在明显差异，可能是因为分子中C3 位的羟基被糖基取代，而C2-C3 位双键是黄酮化合物抗肿瘤活性的一个关键因素，因此异槲皮苷抗肿瘤活性显著下降[22]。
为进一步明确中华补血草黄酮类化合物的抗肿瘤机制，本研究运用DPPH自由基清除试验，比较5种黄酮类化合物的体外抗氧化活性，发现5种化合物在本试验浓度范围内均具有良好的DPPH自由基清除活性，并随浓度的增加清除作用增强。其中槲皮素、木樨草素、异鼠李素抗氧化活性较强，异槲皮苷、芹菜素较弱。进一步研究发现，5种黄酮的抗肿瘤活性与抗氧化活性强弱比较接近，但并不完全一致，表明中华补血草黄酮类化合物抗氧化活性是其发挥抗肿瘤作用的重要因素，其他抗肿瘤机制还有待于进一步研究阐明。
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