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摘要：光敏色素是植物重要的光受体之一，主要感受红光和远红光。水稻光敏色素基因家族包括3个成员，即PHYA、PHYB 和PHYC。我们已有研究表明PHYB在水稻生长发育和胁迫反应中具有重要作用。然而目前缺乏有效的水稻PHYB蛋白质抗体，极大地制约着PHYB基因作用机制的解析。在本研究中，我们比较了水稻光敏色素家族3个成员氨基酸序列同源性，选取了PHYB蛋白质C端的特异多肽。在此基础上，分离了特异多肽对应的cDNA序列，将其克隆在原核表达载体pET16b上，利用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导、纯化获得了PHYB蛋白质特异性抗原，通过免疫新西兰大白兔，制备了PHYB蛋白的多克隆抗体。免疫印迹检测表明该抗体具有很高的特异性。本研究为深入解析PHYB基因在水稻生长发育中的作用机制提供了必要保障。
关键词：水稻；光敏色素；原核表达；抗体
中图分类号：S511：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0001-06
Abstract Phytochrome （PHY） is one of the important photoreceptors in plant. Phytochrome family mainly senses red and far-red lights. Rice phytochrome gene family is composed of three members known as PHYA， PHYB， and PHYC. Our previous studies has suggested that PHYB plays important roles in regulating rice growth and development as well as stress responses. However， absence of effective PHYB antibody greatly hinders the dissection of mechanisms of PHYB functions in rice. In this study， we selected the peptide specific to PHYB protein by comparing the amino acid identity among three rice phytochrome members. The cDNA fragment encoding specific PHYB peptide was isolated and cloned into prokaryotic expression vector pET16b. The PHYB antigen was obtained after isopropyl thio-beta-d-galactose（IPTG）induction and purification of expressed protein. The polyclonal PHYB antibody was prepared by immunizing New Zealand rabbits. Western blotting assays revealed that PHYB polycolonal antibody prepared in this study was specific to detect PHYB protein in rice extracts. The results from this study were necessary for comprehensively exploring the functional mechanism of PHYB in rice.
Keywords Rice； Phytochrome； Prokaryotic expression； Antibody
对高等植物而言，光不仅是光合作用的能量来源，也是一种重要的环境信号因子[1]。高等植物利用光敏色素（phytochromes）、隐花色素（cryptochromes）和向光素（phototropins）等光受体感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光（red light，R）和远红光（far-red light，FR）[2]。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB 和PHYC[3-6]。图位克隆和全基因组检索显示，PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，且为单拷贝。Takano等[7]通过伽马射线诱导突变体筛选得到了多个phyB突变体。通过比较野生型和phyB 突变体的光形态建成特征，发现PHYB在水稻生长发育中具有重要作用，如PHYB可以影响水稻幼苗的去黄化、幼苗主根的伸长和根系的发育，还影响水稻的花期、育性以及氣孔的形态和数目等特征[8-10]。近几年，本课题组研究发现，水稻phyB突变体具有较强的耐旱性和耐低温能力[11，12]，因此phyB突变体可以作为重要的种质资源用于水稻早熟、耐逆品种的培育。
然而，关于PHYB在水稻生长发育中的作用机制研究还有待深入。蛋白质印记技术 （Western Blot）可以利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中特定目的蛋白，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。因此PHYB蛋白特异抗体的制备对解析PHYB基因的作用机制具有重要作用。然而，目前还没有有效的商业化水稻PHYB蛋白质抗体可以使用。本研究拟探索PHYB抗体的制备方法，并对其特异性进行检测，以期为深入解析PHYB基因在水稻生长发育和胁迫反应中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 本研究所用水稻材料是日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）、phyB突变体（phyB-1，其遗传背景的详细描述参考Takano等[7]的报道）。pET16b表达载体，购自Novagen 公司（其中包含广泛使用的IPTG诱导的启动子tac，用于亲和纯化融合的标签His-Tag）；克隆宿主菌为E. coli DH5α，表达宿主菌为E. coli BL21（DE3），均购于全式金公司。免疫动物为购买的新西兰大白兔。
1.2 PHYB特异cDNA片段扩增
采用TRIZOL试剂（Invitrogen）提取日本晴叶片总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。按反转录酶SuperScript Ⅱ（Invitrogen）说明书将其反转录成cDNA，以合成的第一链cDNA为模板扩增目的基因。
通过比较水稻光敏色素家族蛋白的同源性，选取PHYB 蛋白质C端特异的多肽序列，根据其对应的cDNA，设计上游引物phyBhisF：5′-AACCATGGGCCCAGATGCATTAACGAAATTC-3′和下游引物phyBhisR：5′-ATCCATGGTGCTTGTCCCCCTACTTG-3′（下划线部分序列为NcoⅠ位点）。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer（TaKaRa）扩增目的片段，PCR反应体系为50 μL，包括2×PrimeSTARTMGC Buffer（TaKaRa）25 μL、dNTP Mixture 4 μL、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase 0.5 μL、cDNA模板200 ng、0.2 μmol/L基因特异性引物对。PCR反应条件是94℃预变性1 min；然后98℃ 10 s，68℃ 1 min，30个循环。PCR完毕后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.3 PHYB特异cDNA片段原核表达载体的构建
将得到的PHYB特异cDNA片段PCR产物用NcoⅠ单酶切，回收插入片段；用同样的方法单酶切pET16b（Amp抗性）原核表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段在4℃环境连接过夜，转化大肠杆菌E. coli DH5α，筛选阳性克隆并测序，挑取序列正确的阳性克隆扩大培养并提取质粒，得到重组载体，命名为pET16b-PHYB。将构建的重组载体，转化表达宿主菌E. coli BL21（DE3）。
1.4 PHYB重组蛋白的诱导表达和初步纯化
1.4.1 重组蛋白的小量诱导表达及电泳检测 挑取含重组质粒pET16b-PHYB的菌体单斑至2 mL LB液体培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃过夜培养。次日按1∶100比例稀释过夜菌，取50 μL菌加入到5 mL LB培養基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振荡培养3 h （OD600≈0.6）。取部分菌液作为未诱导的对照组（0 h），余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1 mmol/L作为试验组，分三组37℃、200 r/min分别继续振荡培养2、4、6 h。
分别取菌液1 mL，12 000×g离心30 s收获沉淀，用50 μL的5×凝胶电泳上样缓冲液重悬，混匀，100℃煮沸10 min，冰上放置2 min， 12 000×g离心10 min，取上清作为样品，利用12% SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色检测。
1.4.2 重组蛋白的大量诱导表达及纯化 挑取含重组质粒pET16b-PHYB的菌体单斑至2 mL LB液体培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃过夜培养。次日按1∶100比例稀释过夜菌，取200 μL菌加入到20 mL LB培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振荡培养3 h （OD600≈0.6）。加入IPTG诱导剂至终浓度1 mmol/L，继续37℃、200 r/min振荡培养4 h。
取全部菌液，7 000 r/min离心20 min，4℃收获沉淀。用5 mL悬浮液（1×TE+1 mol/L NaCl+1% Triton X-100）悬浮沉淀。使用超声波破碎仪（SONICS VCX 150）破碎菌体，具体为将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理10 s，间隔10 s使菌液冷却，破碎10 min，输出振幅设为30%。在冰上放置 30 min 后，15 000 r/min离心5 min，4℃收获沉淀 （保存上清液1号）。继续向沉淀加入5 mL悬浮液，如上超声破碎并冰浴，离心收集沉淀，这样重复6次，保存第6次上清（上清液6号），收集第6次沉淀，最后一次沉淀用1 mL 1×TE buffer 悬浮。取20 μL重新溶解的沉淀，加5 μL 5×凝胶电泳上样缓冲液，同时用上清液1号和上清液6号作为对照，进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测。
1.5 多克隆抗体血清的制备
免疫动物选择三个月左右、体重2 kg以上的健康新西兰大白兔，用已制备的PHYB重组蛋白作为抗原免疫动物。具体为将PHYB原核表达产物经12% SDS-PAGE电泳后，用预冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取含有目的蛋白的胶条，按1∶1比例（W/V）加入0.9%生理盐水在预冷的研钵中研磨。将获得的目的蛋白加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫两周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次（共进行四次免疫）。第三次免疫12 d后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者于第四次免疫11 d后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜，在4℃条件下，5 000 r/min离心10 min，收集血清，分装后-80℃保存。 1.6 PHYB多克隆抗体特异性鉴定
日本晴及phyB突变体水稻种子表面消毒后，播种于0.4%（W/V）的琼脂培养基中，在28℃黑暗培养箱生长7 d后，分别取日本晴和突变体水稻的地上部分，在液氮中速冻，然后通过蛋白提取液（100 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5；5 mmol/L EDTA，pH值8.0；0.2%巯基乙醇；100 mmol/L PMSF）提取蛋白，利用硫酸铵盐析除去大部分杂蛋白，冰上放置30 min，15 000 r/min离心30 min，用1/10体积的蛋白提取缓冲液溶解沉淀，从而得到初步分离纯化的蛋白质，然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。配制10%分离胶、5%浓缩胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳上样量为50 ng蛋白，加入5×凝胶上样缓冲液至终浓度为1×。沸水中煮5 min使蛋白变性，加足够电泳液后准备上样，电泳时间1～2 h，先用80 V电压，当观察到溴酚蓝位于浓缩胶和分离胶交界处时，将电压调至120 V，直至溴酚蓝跑到胶的最底端。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到PVDF膜上，用TBST（1 mol/L Tris-HCl，pH值7.5；0.5 mol/L NaCl；0.1% Tween 20）配制5%脱脂奶粉室温封闭1～2 h。加入制备的PHYB抗体（以3∶10 000进行稀释）作为一抗，与PVDF膜孵育后，进行洗膜，然后以1∶10 000稀释的碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，经过底物避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
2 结果与分析
2.1 PHYB特异cDNA片段的克隆
我们比较了水稻光敏色素家族3个成员氨基酸序列同源性，发现其C端同源性较低（图1），故选取PHYB蛋白质C端特异多肽对应的cDNA序列设计引物。利用设计的特异引物，以野生型水稻日本晴叶片cDNA为模板，经RT-PCR获得PHYB特异cDNA序列，约1 000 bp（图2）。将该片段克隆至pET16b载体上，测序结果显示，该片段长951 bp，如图3A所示。利用NCBI ORF finder软件预测其氨基酸序列，该特异序列编码317个氨基酸，分子量大小为36 kD（图3B）。
2.2 PHYB重组蛋白诱导表达和纯化
以1∶100比例稀释重组质粒菌体单斑的过夜菌继续培养3 h为最佳诱导开始时间，通过IPTG诱导剂分别小量诱导表达蛋白0、2、4、6 h，经SDS-PAGE电泳（图4A），在分子量36 kD处有明显条带，与预期PHYB重组蛋白分子量大小一致。经过大量扩繁、诱导收集（选择诱导时间为4 h）、六次超声破碎重悬蛋白菌体后获得第1次上清、第6次上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳分析（图4B）显示，PHYB重组蛋白只出现在沉淀中，上清中没有，说明PHYB重组蛋白形成了包涵体。
2.3 PHYB多克隆抗体的特异性检验
利用获得的PHYB多克隆抗体对日本晴及phyB突变体进行蛋白免疫印迹试验，我们预测PHYB蛋白质的分子量大约107 kD，由图5可见，在日本晴蛋白提取物上样的泳道中出现一条分子量约100 kD的蛋白带，与预测的PHYB蛋白质基本一致，而phyB突变体上样的泳道中没有出现，说明制备的PHYB多克隆抗体与野生型中的PHYB蛋白有特异性免疫反应，具有非常好的特异性。
3 讨论与结论
在本研究中，我们比较了水稻光敏色素家族3个成员氨基酸序列同源性，选取了PHYB蛋白质C端特异多肽。首次通过在原核细菌中表达PHYB的C端多肽作为抗原，通过免疫兔子制备了特异性的PHYB蛋白质的多克隆抗体，通过样品检测证明了抗体的适用性，且该抗体具有很高的特异性。为深入解析PHYB基因在水稻生长发育中的作用机制提供了必要保障。
本研究制备的多克隆抗体特异性好，可与水稻光敏色素蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻不同生长条件下、不同发育时期的光敏色素蛋白质的表达情况进行分析研究，也可用于免疫共沉淀技术以分析PHYB蛋白质与其它蛋白质之间的相互作用。但是该抗体免疫杂交结果显示有背景杂带，这对于那些对抗体特异性要求特别高的试验是不合适的，如染色体免疫共沉淀试验。对于这类试验，我们需要进一步纯化抗体。
参考文献：
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[7]Takano M， Inagaki N， Xie X， et al. Distinct and cooperative functions of phytochromes A， B， and C in the control of deetiolation and flowering in rice[J]. The Plant Cell， 2005，17（12）：3311-3325.
[8]Takano M，Kanegae H，Shinomura T，et al. Isolation and characterization of rice phytochrome A mutants[J]. The Plant Cell，2001，13： 521-534.
[9]Xie X， Shinomura T， Inagaki N， et al. Phytochrome-mediated inhibition of coleoptile growth in rice： age-dependency and action spectra [J]. Photochemistry & Photobiology， 2007， 83（1）：131-138.
[10]Takano M， Inagaki N， Xie X， et al. Phytochromes are the sole photoreceptors for perceiving red/far-red light in rice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（34）：14705-14710.
[11]Liu J， Zhang F， Zhou J J， et al. Phytochrome B control of total leaf area and stomatal density affects drought tolerance in rice [J]. Plant Molecular Biology， 2012， 78： 289-300.
[12]周晉军， 刘蓬， 尹静静，等. 脯氨酸代谢途径在调控水稻phyB突变体干旱胁迫耐性中的作用[J]. 山东农业科学， 2014（3）：1-4.
关键词：水稻；光敏色素；原核表达；抗体
中图分类号：S511：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0001-06
Abstract Phytochrome （PHY） is one of the important photoreceptors in plant. Phytochrome family mainly senses red and far-red lights. Rice phytochrome gene family is composed of three members known as PHYA， PHYB， and PHYC. Our previous studies has suggested that PHYB plays important roles in regulating rice growth and development as well as stress responses. However， absence of effective PHYB antibody greatly hinders the dissection of mechanisms of PHYB functions in rice. In this study， we selected the peptide specific to PHYB protein by comparing the amino acid identity among three rice phytochrome members. The cDNA fragment encoding specific PHYB peptide was isolated and cloned into prokaryotic expression vector pET16b. The PHYB antigen was obtained after isopropyl thio-beta-d-galactose（IPTG）induction and purification of expressed protein. The polyclonal PHYB antibody was prepared by immunizing New Zealand rabbits. Western blotting assays revealed that PHYB polycolonal antibody prepared in this study was specific to detect PHYB protein in rice extracts. The results from this study were necessary for comprehensively exploring the functional mechanism of PHYB in rice.
Keywords Rice； Phytochrome； Prokaryotic expression； Antibody
对高等植物而言，光不仅是光合作用的能量来源，也是一种重要的环境信号因子[1]。高等植物利用光敏色素（phytochromes）、隐花色素（cryptochromes）和向光素（phototropins）等光受体感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光（red light，R）和远红光（far-red light，FR）[2]。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB 和PHYC[3-6]。图位克隆和全基因组检索显示，PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，且为单拷贝。Takano等[7]通过伽马射线诱导突变体筛选得到了多个phyB突变体。通过比较野生型和phyB 突变体的光形态建成特征，发现PHYB在水稻生长发育中具有重要作用，如PHYB可以影响水稻幼苗的去黄化、幼苗主根的伸长和根系的发育，还影响水稻的花期、育性以及氣孔的形态和数目等特征[8-10]。近几年，本课题组研究发现，水稻phyB突变体具有较强的耐旱性和耐低温能力[11，12]，因此phyB突变体可以作为重要的种质资源用于水稻早熟、耐逆品种的培育。
然而，关于PHYB在水稻生长发育中的作用机制研究还有待深入。蛋白质印记技术 （Western Blot）可以利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中特定目的蛋白，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。因此PHYB蛋白特异抗体的制备对解析PHYB基因的作用机制具有重要作用。然而，目前还没有有效的商业化水稻PHYB蛋白质抗体可以使用。本研究拟探索PHYB抗体的制备方法，并对其特异性进行检测，以期为深入解析PHYB基因在水稻生长发育和胁迫反应中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 本研究所用水稻材料是日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）、phyB突变体（phyB-1，其遗传背景的详细描述参考Takano等[7]的报道）。pET16b表达载体，购自Novagen 公司（其中包含广泛使用的IPTG诱导的启动子tac，用于亲和纯化融合的标签His-Tag）；克隆宿主菌为E. coli DH5α，表达宿主菌为E. coli BL21（DE3），均购于全式金公司。免疫动物为购买的新西兰大白兔。
1.2 PHYB特异cDNA片段扩增
采用TRIZOL试剂（Invitrogen）提取日本晴叶片总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。按反转录酶SuperScript Ⅱ（Invitrogen）说明书将其反转录成cDNA，以合成的第一链cDNA为模板扩增目的基因。
通过比较水稻光敏色素家族蛋白的同源性，选取PHYB 蛋白质C端特异的多肽序列，根据其对应的cDNA，设计上游引物phyBhisF：5′-AACCATGGGCCCAGATGCATTAACGAAATTC-3′和下游引物phyBhisR：5′-ATCCATGGTGCTTGTCCCCCTACTTG-3′（下划线部分序列为NcoⅠ位点）。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer（TaKaRa）扩增目的片段，PCR反应体系为50 μL，包括2×PrimeSTARTMGC Buffer（TaKaRa）25 μL、dNTP Mixture 4 μL、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase 0.5 μL、cDNA模板200 ng、0.2 μmol/L基因特异性引物对。PCR反应条件是94℃预变性1 min；然后98℃ 10 s，68℃ 1 min，30个循环。PCR完毕后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.3 PHYB特异cDNA片段原核表达载体的构建
将得到的PHYB特异cDNA片段PCR产物用NcoⅠ单酶切，回收插入片段；用同样的方法单酶切pET16b（Amp抗性）原核表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段在4℃环境连接过夜，转化大肠杆菌E. coli DH5α，筛选阳性克隆并测序，挑取序列正确的阳性克隆扩大培养并提取质粒，得到重组载体，命名为pET16b-PHYB。将构建的重组载体，转化表达宿主菌E. coli BL21（DE3）。
1.4 PHYB重组蛋白的诱导表达和初步纯化
1.4.1 重组蛋白的小量诱导表达及电泳检测 挑取含重组质粒pET16b-PHYB的菌体单斑至2 mL LB液体培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃过夜培养。次日按1∶100比例稀释过夜菌，取50 μL菌加入到5 mL LB培養基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振荡培养3 h （OD600≈0.6）。取部分菌液作为未诱导的对照组（0 h），余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1 mmol/L作为试验组，分三组37℃、200 r/min分别继续振荡培养2、4、6 h。
分别取菌液1 mL，12 000×g离心30 s收获沉淀，用50 μL的5×凝胶电泳上样缓冲液重悬，混匀，100℃煮沸10 min，冰上放置2 min， 12 000×g离心10 min，取上清作为样品，利用12% SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色检测。
1.4.2 重组蛋白的大量诱导表达及纯化 挑取含重组质粒pET16b-PHYB的菌体单斑至2 mL LB液体培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃过夜培养。次日按1∶100比例稀释过夜菌，取200 μL菌加入到20 mL LB培养基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振荡培养3 h （OD600≈0.6）。加入IPTG诱导剂至终浓度1 mmol/L，继续37℃、200 r/min振荡培养4 h。
取全部菌液，7 000 r/min离心20 min，4℃收获沉淀。用5 mL悬浮液（1×TE+1 mol/L NaCl+1% Triton X-100）悬浮沉淀。使用超声波破碎仪（SONICS VCX 150）破碎菌体，具体为将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理10 s，间隔10 s使菌液冷却，破碎10 min，输出振幅设为30%。在冰上放置 30 min 后，15 000 r/min离心5 min，4℃收获沉淀 （保存上清液1号）。继续向沉淀加入5 mL悬浮液，如上超声破碎并冰浴，离心收集沉淀，这样重复6次，保存第6次上清（上清液6号），收集第6次沉淀，最后一次沉淀用1 mL 1×TE buffer 悬浮。取20 μL重新溶解的沉淀，加5 μL 5×凝胶电泳上样缓冲液，同时用上清液1号和上清液6号作为对照，进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测。
1.5 多克隆抗体血清的制备
免疫动物选择三个月左右、体重2 kg以上的健康新西兰大白兔，用已制备的PHYB重组蛋白作为抗原免疫动物。具体为将PHYB原核表达产物经12% SDS-PAGE电泳后，用预冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取含有目的蛋白的胶条，按1∶1比例（W/V）加入0.9%生理盐水在预冷的研钵中研磨。将获得的目的蛋白加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫两周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次（共进行四次免疫）。第三次免疫12 d后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者于第四次免疫11 d后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜，在4℃条件下，5 000 r/min离心10 min，收集血清，分装后-80℃保存。 1.6 PHYB多克隆抗体特异性鉴定
日本晴及phyB突变体水稻种子表面消毒后，播种于0.4%（W/V）的琼脂培养基中，在28℃黑暗培养箱生长7 d后，分别取日本晴和突变体水稻的地上部分，在液氮中速冻，然后通过蛋白提取液（100 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5；5 mmol/L EDTA，pH值8.0；0.2%巯基乙醇；100 mmol/L PMSF）提取蛋白，利用硫酸铵盐析除去大部分杂蛋白，冰上放置30 min，15 000 r/min离心30 min，用1/10体积的蛋白提取缓冲液溶解沉淀，从而得到初步分离纯化的蛋白质，然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。配制10%分离胶、5%浓缩胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳上样量为50 ng蛋白，加入5×凝胶上样缓冲液至终浓度为1×。沸水中煮5 min使蛋白变性，加足够电泳液后准备上样，电泳时间1～2 h，先用80 V电压，当观察到溴酚蓝位于浓缩胶和分离胶交界处时，将电压调至120 V，直至溴酚蓝跑到胶的最底端。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到PVDF膜上，用TBST（1 mol/L Tris-HCl，pH值7.5；0.5 mol/L NaCl；0.1% Tween 20）配制5%脱脂奶粉室温封闭1～2 h。加入制备的PHYB抗体（以3∶10 000进行稀释）作为一抗，与PVDF膜孵育后，进行洗膜，然后以1∶10 000稀释的碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，经过底物避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
2 结果与分析
2.1 PHYB特异cDNA片段的克隆
我们比较了水稻光敏色素家族3个成员氨基酸序列同源性，发现其C端同源性较低（图1），故选取PHYB蛋白质C端特异多肽对应的cDNA序列设计引物。利用设计的特异引物，以野生型水稻日本晴叶片cDNA为模板，经RT-PCR获得PHYB特异cDNA序列，约1 000 bp（图2）。将该片段克隆至pET16b载体上，测序结果显示，该片段长951 bp，如图3A所示。利用NCBI ORF finder软件预测其氨基酸序列，该特异序列编码317个氨基酸，分子量大小为36 kD（图3B）。
2.2 PHYB重组蛋白诱导表达和纯化
以1∶100比例稀释重组质粒菌体单斑的过夜菌继续培养3 h为最佳诱导开始时间，通过IPTG诱导剂分别小量诱导表达蛋白0、2、4、6 h，经SDS-PAGE电泳（图4A），在分子量36 kD处有明显条带，与预期PHYB重组蛋白分子量大小一致。经过大量扩繁、诱导收集（选择诱导时间为4 h）、六次超声破碎重悬蛋白菌体后获得第1次上清、第6次上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳分析（图4B）显示，PHYB重组蛋白只出现在沉淀中，上清中没有，说明PHYB重组蛋白形成了包涵体。
2.3 PHYB多克隆抗体的特异性检验
利用获得的PHYB多克隆抗体对日本晴及phyB突变体进行蛋白免疫印迹试验，我们预测PHYB蛋白质的分子量大约107 kD，由图5可见，在日本晴蛋白提取物上样的泳道中出现一条分子量约100 kD的蛋白带，与预测的PHYB蛋白质基本一致，而phyB突变体上样的泳道中没有出现，说明制备的PHYB多克隆抗体与野生型中的PHYB蛋白有特异性免疫反应，具有非常好的特异性。
3 讨论与结论
在本研究中，我们比较了水稻光敏色素家族3个成员氨基酸序列同源性，选取了PHYB蛋白质C端特异多肽。首次通过在原核细菌中表达PHYB的C端多肽作为抗原，通过免疫兔子制备了特异性的PHYB蛋白质的多克隆抗体，通过样品检测证明了抗体的适用性，且该抗体具有很高的特异性。为深入解析PHYB基因在水稻生长发育中的作用机制提供了必要保障。
本研究制备的多克隆抗体特异性好，可与水稻光敏色素蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻不同生长条件下、不同发育时期的光敏色素蛋白质的表达情况进行分析研究，也可用于免疫共沉淀技术以分析PHYB蛋白质与其它蛋白质之间的相互作用。但是该抗体免疫杂交结果显示有背景杂带，这对于那些对抗体特异性要求特别高的试验是不合适的，如染色体免疫共沉淀试验。对于这类试验，我们需要进一步纯化抗体。
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