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【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2015）01
【摘要】目的 患者外周血贴壁单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）诱导的树突状细胞（dendritic cells，DCs）与杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）对人肝癌HEPG2细胞系周期、凋亡的影响。方法 用经GM-CSF，TNF、及IL-4等诱导该患者PBMC产生的DCs。用IFN-y，IL-2和人CD3单克隆抗体（human CD3 monoclonal antibody hCD3mAb）等诱导该PBMC的悬浮细胞产生CIK细胞。用Transwell培养小室将DC-CIK细胞与HEPG2细胞在同一培养体系内经该小室膜分隔培养24.48 h。流式细胞仪检测该HEPG2细胞的周期；Annexin VII双染法检测其凋亡。RT-CR， Western blot分别检测凋亡相关基因Bax及其编码蛋白的表达。结果 DC-CIK细胞可明显影响人HEPG2细胞生长周期，两者共培养，可将HEPG2细胞系阻滞于G期。DC-CIK细胞能显著诱导HEPG2细胞的凋亡，与对照相比，其凋亡诱导率差异显著（P < 0. 01）。基因与蛋白水平检测表明，DC-CIK细胞可致HEPG2细胞系的凋亡相关基因Bax表达明显上调。结论肝癌患者DC-CIK细胞可明显抑制肝癌HEPG2细胞系的生长，显著诱导该细胞凋亡，且该凋亡诱导具“时间-依赖”与“细胞数量-依赖”特性。
【关键词】DC-CIK细胞；肝癌HEPG2细胞；细胞周期；细胞凋亡
近些年，自体细胞免疫治疗己成为治疗恶性肿瘤的重要辅助手段之一，并显示了一定的临床前景，但其疗效各异、机制不清。临床首选树突状细胞（dendriticcell，DC）与细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced kil-ler，CIK）细胞。DC是体内唯一能刺激初始型T淋巴细胞的功能强大之专职抗原递呈细胞，能始动机体免疫应答，诱导持久的特异性抗瘤免疫反应。CIK细胞是一组以CD3CD56T细胞为主要效应的异质细胞群，兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤特性，是目前肿瘤生物治疗首选细胞之一，可通过非特异性免疫杀伤作用根治肿瘤患者体内微小残余病灶。DC与CIK细胞具有一定互补作用，二者联合可获“1 +1 >2”之疗效。为提高晚期实体瘤患者的生活质量并延长其生存期，我们将自身CIK细胞联合自身DC用于110例晚期恶性实体瘤患者，取得了较好的在体疗效。本实验从离体水平研究细胞因子从肝癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell PBMC）诱导的树突状细胞（ dendritic cell，DC）与杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞对肝癌HEPG2细胞系周期、凋亡的影响，探讨DC与CIK细胞的离体杀瘤效应及其机制，为肿瘤的自体细胞免疫治疗奠定基础。
肝癌属极常见的恶性肿瘤，现代生物技术的迅猛发展为肝癌的治疗带来了新的希望。肿瘤生物治疗（免疫细胞、基因、分子靶向、内分泌及干细胞等治疗）己成为继手术、放疗、化疗后第4种治疗手段，并显示出良好的应用前景，受众多医学工作者的广泛关注与高度重视，其中免疫细胞治疗最广泛，亦最能体现生物治疗特色，包括淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞、肿瘤浸润淋巴（TIL）细胞与CD3单抗激活的杀伤（CD3AK）细胞等，体外均具有一定的杀瘤活性，但因细胞的扩增量少，细胞毒力不强，故其临床应用受限。
树突状细胞（DCs）最初由Steinman等分离发现于小鼠的脾组织，因其形态具伪足样突起或树突而得名，是启动、调控、维持免疫反应的中心环节。其具有激发T细胞增殖及抗原递呈能力，该能力为巨噬细胞和B细胞的100—1000倍。CIK细胞由多种细胞因子、CD3单抗与人外周血或骨髓单个核细胞在體外共同培养诱导而来，亦称自然杀伤（NK）细胞样T淋巴细胞回，其在外周血淋巴细胞中之比例为1%—5%。肿瘤的CIK细胞治疗可克服过继免疫疗法的缺陷，如体外细胞增殖数量少、疗效低、需输注IL—2及副作用大等，己成为肿瘤生物治疗的新措施之一。CIK细胞能分泌多种细胞因子，强于LAK， TIL与CD3AK等细胞的杀瘤活性。但以往相关研究多以体外培养的单纯DC，CIK细胞进行肝癌的生物治疗，因缺乏对肿瘤细胞的特异性，其疗效不佳。可见，肿瘤细胞对诸如CIK细胞的免疫效应细胞发生抵抗，其原因可能与瘤患者功能性DCs细胞缺乏有关。
因此，为提高其特异的抗瘤效应，我们将自身CIK细胞联合DC用于治疗肝癌患者，取得了较好在体疗效。本实验从成人外周血中分离DCs与CIK细胞对肝癌HEPG2细胞系周期与凋亡的影响，探讨负载肿瘤抗原的DCs与CIK细胞的离体杀瘤效应及其机制。细胞凋亡的检测显示，HEPG2细胞与其一半密度的DC-DCK细胞共培养24 h和48 h的细胞凋亡率相比，差异具统计学意义（P<0.01） ； HEPG2细胞与其相同密度的DC-DCK细胞共培养48 h的细胞凋亡率与HEPG2细胞与其一半密度的DC-DCK细胞共培养作用相同时间比较，差异也具统计学意义（P<0.05）。提示DC-DCK细胞释放物能显著杀伤HEPG2细胞，能诱导HEPG2细胞的凋亡，且该凋亡具“时间刁衣赖”与“细胞数量刁衣赖”特性。细胞周期的检测显示，肝癌HEPG2细胞系与相同密度及一半密度的DC-DCK细胞共培养48 h，与正常对照相比，两者都使该细胞系的G1期细胞增加13.51 %，G2期细胞降低11.98%，S期细胞降低1.53 %，HEPG2细胞系被阻滞于G1期。可见，DC-DCK细胞能抑制肝癌细胞的生长。基因与蛋白水平检测表明，DC-DCK细胞与HEPG2细胞共培养可显著致HEPG2细胞凋亡。
参考文献
[1]Park HY，Jin JO， Song MU，et al. Expression of dendritic cell markers on cultured ncutrophils and its modulation by anti-apoptotic and pro-apoptotic compounds[J].Exp Mol Mcd，2007，39（4）：439-449.
[2] 匡志鹏，梁安民.ClK细胞联合树突状细胞治疗恶性肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学，2006，14（2）；240-242.
[3]Marin V，Pizzitola l，Agostoni V， ct al. Cytokin}induccd killer cells for cell therapy of acute myeloid leukemia； im-provement of their immune activity by expression of CD33-specific chimeric receptors[1J].Hematology， 2010，95（12）：2144-2152.
【摘要】目的 患者外周血贴壁单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）诱导的树突状细胞（dendritic cells，DCs）与杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）对人肝癌HEPG2细胞系周期、凋亡的影响。方法 用经GM-CSF，TNF、及IL-4等诱导该患者PBMC产生的DCs。用IFN-y，IL-2和人CD3单克隆抗体（human CD3 monoclonal antibody hCD3mAb）等诱导该PBMC的悬浮细胞产生CIK细胞。用Transwell培养小室将DC-CIK细胞与HEPG2细胞在同一培养体系内经该小室膜分隔培养24.48 h。流式细胞仪检测该HEPG2细胞的周期；Annexin VII双染法检测其凋亡。RT-CR， Western blot分别检测凋亡相关基因Bax及其编码蛋白的表达。结果 DC-CIK细胞可明显影响人HEPG2细胞生长周期，两者共培养，可将HEPG2细胞系阻滞于G期。DC-CIK细胞能显著诱导HEPG2细胞的凋亡，与对照相比，其凋亡诱导率差异显著（P < 0. 01）。基因与蛋白水平检测表明，DC-CIK细胞可致HEPG2细胞系的凋亡相关基因Bax表达明显上调。结论肝癌患者DC-CIK细胞可明显抑制肝癌HEPG2细胞系的生长，显著诱导该细胞凋亡，且该凋亡诱导具“时间-依赖”与“细胞数量-依赖”特性。
【关键词】DC-CIK细胞；肝癌HEPG2细胞；细胞周期；细胞凋亡
近些年，自体细胞免疫治疗己成为治疗恶性肿瘤的重要辅助手段之一，并显示了一定的临床前景，但其疗效各异、机制不清。临床首选树突状细胞（dendriticcell，DC）与细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced kil-ler，CIK）细胞。DC是体内唯一能刺激初始型T淋巴细胞的功能强大之专职抗原递呈细胞，能始动机体免疫应答，诱导持久的特异性抗瘤免疫反应。CIK细胞是一组以CD3CD56T细胞为主要效应的异质细胞群，兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤特性，是目前肿瘤生物治疗首选细胞之一，可通过非特异性免疫杀伤作用根治肿瘤患者体内微小残余病灶。DC与CIK细胞具有一定互补作用，二者联合可获“1 +1 >2”之疗效。为提高晚期实体瘤患者的生活质量并延长其生存期，我们将自身CIK细胞联合自身DC用于110例晚期恶性实体瘤患者，取得了较好的在体疗效。本实验从离体水平研究细胞因子从肝癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell PBMC）诱导的树突状细胞（ dendritic cell，DC）与杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞对肝癌HEPG2细胞系周期、凋亡的影响，探讨DC与CIK细胞的离体杀瘤效应及其机制，为肿瘤的自体细胞免疫治疗奠定基础。
肝癌属极常见的恶性肿瘤，现代生物技术的迅猛发展为肝癌的治疗带来了新的希望。肿瘤生物治疗（免疫细胞、基因、分子靶向、内分泌及干细胞等治疗）己成为继手术、放疗、化疗后第4种治疗手段，并显示出良好的应用前景，受众多医学工作者的广泛关注与高度重视，其中免疫细胞治疗最广泛，亦最能体现生物治疗特色，包括淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞、肿瘤浸润淋巴（TIL）细胞与CD3单抗激活的杀伤（CD3AK）细胞等，体外均具有一定的杀瘤活性，但因细胞的扩增量少，细胞毒力不强，故其临床应用受限。
树突状细胞（DCs）最初由Steinman等分离发现于小鼠的脾组织，因其形态具伪足样突起或树突而得名，是启动、调控、维持免疫反应的中心环节。其具有激发T细胞增殖及抗原递呈能力，该能力为巨噬细胞和B细胞的100—1000倍。CIK细胞由多种细胞因子、CD3单抗与人外周血或骨髓单个核细胞在體外共同培养诱导而来，亦称自然杀伤（NK）细胞样T淋巴细胞回，其在外周血淋巴细胞中之比例为1%—5%。肿瘤的CIK细胞治疗可克服过继免疫疗法的缺陷，如体外细胞增殖数量少、疗效低、需输注IL—2及副作用大等，己成为肿瘤生物治疗的新措施之一。CIK细胞能分泌多种细胞因子，强于LAK， TIL与CD3AK等细胞的杀瘤活性。但以往相关研究多以体外培养的单纯DC，CIK细胞进行肝癌的生物治疗，因缺乏对肿瘤细胞的特异性，其疗效不佳。可见，肿瘤细胞对诸如CIK细胞的免疫效应细胞发生抵抗，其原因可能与瘤患者功能性DCs细胞缺乏有关。
因此，为提高其特异的抗瘤效应，我们将自身CIK细胞联合DC用于治疗肝癌患者，取得了较好在体疗效。本实验从成人外周血中分离DCs与CIK细胞对肝癌HEPG2细胞系周期与凋亡的影响，探讨负载肿瘤抗原的DCs与CIK细胞的离体杀瘤效应及其机制。细胞凋亡的检测显示，HEPG2细胞与其一半密度的DC-DCK细胞共培养24 h和48 h的细胞凋亡率相比，差异具统计学意义（P<0.01） ； HEPG2细胞与其相同密度的DC-DCK细胞共培养48 h的细胞凋亡率与HEPG2细胞与其一半密度的DC-DCK细胞共培养作用相同时间比较，差异也具统计学意义（P<0.05）。提示DC-DCK细胞释放物能显著杀伤HEPG2细胞，能诱导HEPG2细胞的凋亡，且该凋亡具“时间刁衣赖”与“细胞数量刁衣赖”特性。细胞周期的检测显示，肝癌HEPG2细胞系与相同密度及一半密度的DC-DCK细胞共培养48 h，与正常对照相比，两者都使该细胞系的G1期细胞增加13.51 %，G2期细胞降低11.98%，S期细胞降低1.53 %，HEPG2细胞系被阻滞于G1期。可见，DC-DCK细胞能抑制肝癌细胞的生长。基因与蛋白水平检测表明，DC-DCK细胞与HEPG2细胞共培养可显著致HEPG2细胞凋亡。
参考文献
[1]Park HY，Jin JO， Song MU，et al. Expression of dendritic cell markers on cultured ncutrophils and its modulation by anti-apoptotic and pro-apoptotic compounds[J].Exp Mol Mcd，2007，39（4）：439-449.
[2] 匡志鹏，梁安民.ClK细胞联合树突状细胞治疗恶性肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学，2006，14（2）；240-242.
[3]Marin V，Pizzitola l，Agostoni V， ct al. Cytokin}induccd killer cells for cell therapy of acute myeloid leukemia； im-provement of their immune activity by expression of CD33-specific chimeric receptors[1J].Hematology， 2010，95（12）：2144-2152.