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摘要：为了揭示雷公山山区放牧山羊乙酰辅酶A羧化酶1（ACCl）mRNA表达的组织分布规律，使用TaqMan实时荧光定量技术对黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊的肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌以及皮下脂肪组织中ACCl基因的mRNA表达水平进行测定。结果表明，黔东南小香羊、黔北麻羊、南江黄羊ACCl mRNA均主要在皮下脂肪中表达，其水平分别为3 919.545 6、900.556 8、1 550.559 2；贵州黑山羊ACCl mRNA主要在肝脏内表达，其水平为2 367.425 8；贵州白山羊ACCl mRNA主要在肌肉组织和肝脏中表达，其水平分别为背最长肌420.110 9，心351.436 l，半膜肌268.031 l，肝200.414 1。在皮下脂肪和肝脏，贵州白山羊ACCl mRNA的表达水平都明显低于其他品种。由此可见，雷公山山区放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝脏中表达。
关键词：雷公山山区；放牧山羊；乙酰辅酶1；羧化酶1；ACCl；基因表达
中图分类号：S827.2 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0025-04
雷公山山区位于贵州省东南部，草场面积约1.3万hm2，牧草种类多，工业污染少，非常适合发展生态养羊业。目前，当地人们仍沿用传统放牧的养羊方式，山羊生长过程中沉淀的风味物质多，羊肉质量好。乙酰辅酶A羧化酶（ace@一CoA carboxylase，ACC）是一类在脂肪代谢过程中起重要作用的生物素包含酶，催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A。该酶广泛存在于植物、动物、酵母、真菌、细菌、古细菌等生物体内。在动物体内，乙酰辅酶A羧化酶有乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACCα，别称ACCl）和乙酰辅酶A羧化酶p（acetyl-CoA carboxylase beta，ACCp，别称ACC2）2种类型，这2种酶由不同的基因编码，分子量分别为265、280ku。ACCl主要存在于乳腺、脂肪组织和肝脏的细胞液内，由它催化产生的丙二酸单酰辅酶A主要用于合成脂肪酸，是脂肪酸合成时二碳单位的供体；而ACC2主要分布在心脏、肌肉组织和肝脏的线粒体外膜上，由它催化产生的丙二酸单酰辅酶A主要用于调节肉碱棕榈酸穿梭体。有研究表明，敲除ACC2基因的小鼠体内丙二酸单酰辅酶A的含量低，导致脂肪酸的合成减少，氧化分解加快，脂肪组织和肝脏中堆积的脂肪减少，肝糖原含量下降；因此，乙酰辅酶A羧化酶可调节脂肪酸的生物合成和“β-”氧化，影响机体脂肪的代谢、沉积，进而影响背膘厚等肉质性状。然而，现有资料对家畜ACCl的研究多集中在基因多态性与泌乳性能的关联以及基因启动子方面，鲜见ACCl基因表达及其与肉质性状关系的研究；因此，本研究主要对雷公山山区放牧山羊ACCl基因mRNA的组织分布进行探讨，以摸清其组织表达规律，为肉质性状的遗传标记辅助选择积累基础资料。
1.材料与方法
1.1山羊组织样品来源
5～7月龄黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊各取4只（雌、雄各2只），体质量14～17kg，均购自贵州省雷公山山区养羊户处。将山羊放血处死后，迅速提取心、肝、肺、肾、背最长股、半膜肌、皮下脂肪组织，用锡箔纸包裹后投入液氮中。山羊处死前自由进食和饮水。
1.2引物及探针
PCR引物及TaqMan探针根据山羊ACCl及β-actm’基因mRNA序列设计（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成及修饰。探针的5’、3’一分别由FAM（6一羧基荧光素）和TAMRA（6一羧四甲基罗丹明）修饰。
1.3总RNA提取
总RNA提取采用Invitrogen Trizol RNA试剂盒进行。操作简述如下：在约50 mg经液氮速冻的组织样品中加入1mLTrizol溶液，混匀，裂解5min；加入200uL三氯甲烷，剧烈振荡混匀，静置2min；4℃、12000r/min条件下离心15min，吸取上层水相至另一个新的RNase—flee EP管中；加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；4℃、12000r/min条件下离心10min，收集RNA沉淀；用75%乙醇洗涤2次，超净台风干；加入15～60uLRNase-flee水溶解沉淀。
1.4逆转录反应
逆转录反应采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit进行（20uL体系），具体步骤如下：取总量为0.1～2.Oug的总RNA，加RNase—flee H20混匀至14uL，置于65℃下变性5min，冷却；再加5×RTbuffer4uL、逆转录酶1uL、RT引物1uL，于42℃下逆转录18min，然后于98℃下灭活逆转录酶5min；RT完毕岳将cDNA于一20℃下保存，按所需用量稀释备用。
1.5实时荧光定量标准品的制备
PCR反应采用GeneSolution 2×Taq Master Mix（上海硕盟生物科技有限公司）进行，反应体系总体积为20uL，具体操作如下：向O.2 mL PCR管中依次加入RNase—flee H2O7.2uL、2×Taq Master Mix 10uL、10 t～mol/LS—F0.4uL、10umol/Ls—R0.4uL、cDNA 2uL，混匀。热循环参数为：94℃预变性90s；94℃变性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸60s，40个循环；72℃延伸5min。
PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收纯化后，计算目的基因的拷贝数浓度，式中：Ⅳ为目的基因的拷贝数浓度（copies/uL），C为质量浓度（ng/uL），M为扩增片段的碱基对数。经计算，ACCl基因、β-actm基因的拷贝数浓度为1.39×10111、3.53×107copies/uL。 胶回收产物按4倍比例进行5次梯度稀释。稀释后再次测定质量浓度、换算拷贝数浓度，最终得到拷贝数浓度为1.39×10111、3.64×10l10、9.56×109、2.39×109、5.98×108、1.49×108eopies/p=L的ACCl基因连续梯度定量标准品，以及3.53×107、8.82×106、2.21×106、5.51×105、1.38×105、3.45×104copies/uL的β-actm’基因连续梯度定量标准品。
1.6TaqMan PCR
反应在Funglyn FTC-3000实时荧光定量PCR系统（Funglyn Bioteeh，INC，Canada）上进行，每个样品设置3个重复，同时对空白对照及4倍连续梯度标准品进行定量PCR扩增。TaqMan PCR反应体系为20 p=L，其中含2×Realtime PCRMaster Mix 10.0uL、10umol/L前弓l物0.8uL、10umol/L反引物0.8uL、10umol/L TaqMan探针0.4uL、RNase-fleeH20 6.0uL、cDNA模板2.0uL。热循环参数为：95℃预变性10min；每个循环包括95℃变性15 s，63℃退火及延伸60s，40个循环。
1.7统计分析
根据ACCl及β-actu’t基因连续梯度标准品的拷贝数的对数（以4为底）对相应Ct值作图，得到对应基因的定量标准曲线及回归方程。再根据回归方程与样品检测得到的Ct值即可计算出待测样品中ACCl基因及β-actm’基因的拷贝数。ACCl mRNA的个体表达水平以ACCl基因的拷贝数与β-actm’基因的拷贝数之比值表示，平均表达水平以“中位数”表示。
2.结果与分析
雷公山山区放牧的黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊等山羊品种肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪组织中ACCl基因的mRNA表达水平见表2。
从表2可以看出，黔东南小香羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪最高，为3919.545 6，是心（573.7526）、肝（812.0987）、肺（691.6713）、肾（286.0498）、背最长肌（498.7109）和半膜肌（464.938 8）等组织的4.8倍以上；而肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌中ACCl mRNA的表达水平较接近。黔北麻羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪和肺较高，分别为900.5568和900.1608，是心（542.6041）、肝（288.7994）、肾（579.7442）、背最长肌（318.3583）、半膜肌（472.1422）等组织的1.5倍以上。南江黄羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪最高，为1550.5592，是心（806.7845）、肝（803.6431）、肺（729.9683）、肾（519.4120）、背最长肌（413.832 6）、半膜肌（260.483 3）等组织的1.9倍以上。贵州黑山羊ACCl mRNA的表达水平在肝脏中最高，为2367.4258，是心（592.7209）、肺（762.8970）、肾（321.6677）、背最长肌（240.0147）、半膜肌（274.9263）、皮下脂肪（328.2781）等组织的3.1倍以上。贵州白山羊ACClmRNA的表达水平以背最长肌（420.11109）、心（351.4361）、半膜肌（268.0311）、肝（200.4141）、肺（110.6160）较高，皮下脂肪（77.4306）和肾（22.8188）较低。
此外，在皮下脂肪中，黔东南小香羊和南江黄羊ACClmRNA的表达水平很高，分别为3 919.5456和1 550.5592；其次是黔北麻羊，为900.5568；贵州黑山羊和贵州白山羊则相对较低，分别为328.2781和77.4306。在肝脏中，贵州黑山羊ACCl mRNA的表达水平最高，为2367.4258；黔东南小香羊和南江黄羊较高，分别为812.098 7和803.6431；黔北麻羊和贵州白山羊相对较低，分别为288.7994和200.4141。
3.结论与讨论
3.1雷公山山区放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝脏中表达
肉质性状作为数量性状，受多基因控制，目前发现的候选基因至少有十几个。ACCl是体内脂肪合成的关键酶之一，参与长链脂肪酸从头合成的第1步反应，对调控肝组织的脂肪代谢活动具有重要作用，是猪屠宰及生产性能的标志。ACCl抑制剂能够抑制小鼠体质量增加，减少小鼠的肥胖程度。因此，检测ACCl mRNA水平能够在转录水平上反映体内脂肪合成能力。本研究对5个品种山羊7种组织ACCl基因的表达进行测试，结果表明，有3个品种（黔东南小香羊、黔北麻羊和南江黄羊）_4CCl基因最主要在皮下脂肪组织中表达，1个品种（贵州黑山羊）主要分布于肝脏，另一品种（贵州白山羊）的优势表达组织器官不明确。这与Barber等的报道较相似：他们认为，哺乳动物中ACCl在所有细胞中表达，但主要在肝脏、脂肪组织以及泌乳期乳腺等脂肪生成组织中表达。本研究结果还显示，在皮下脂肪组织中，黔东南小香羊、黔北麻羊和南江黄羊ACCl mRNA的表达水平个体差异较大，这可能是由于皮下脂肪是ACCl基因表达的最主要组织，外界环境和山羊自身条件的微小变化都能引起ACClmRNA表达水平的较大改变，日粮中的氨基酸、中草药、维生素、金属离子等成分以及饱饿状态等因素都能影响ACCl基因的表达。雷公山山区生态环境优美，气候温和湿润，水质好，植物种类繁多，有“天然药园”之称。该区放牧山羊长期摄食这些植物和草药，不仅为其肌肉生长沉淀丰富的风味物质，而且可以通过影响ACCl基因的转录、翻译而最终影响屠宰性能，最终影响山羊的肉品质量。
3.2ACCl mRNA的表达存在品种差异
就品种分布而言，无论是在表达水平最高的皮下脂肪中，还是在表达水平较高的肝脏中，贵州白山羊ACCl mRNA的表达水平都明显低于其他山羊品种，这从转录层面说明贵州白山羊的肝脏和皮下脂肪组织中丙二酸单酰辅酶A的合成能力较弱，生成的丙二酸单酰辅酶A较少，合成脂肪酸的原料不足，脂肪的合成速率降低，分解加快。Solaiman等也发现，ACCl基因的表达具有品种差异，波尔山羊显著高于Kiko山羊。
关键词：雷公山山区；放牧山羊；乙酰辅酶1；羧化酶1；ACCl；基因表达
中图分类号：S827.2 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0025-04
雷公山山区位于贵州省东南部，草场面积约1.3万hm2，牧草种类多，工业污染少，非常适合发展生态养羊业。目前，当地人们仍沿用传统放牧的养羊方式，山羊生长过程中沉淀的风味物质多，羊肉质量好。乙酰辅酶A羧化酶（ace@一CoA carboxylase，ACC）是一类在脂肪代谢过程中起重要作用的生物素包含酶，催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A。该酶广泛存在于植物、动物、酵母、真菌、细菌、古细菌等生物体内。在动物体内，乙酰辅酶A羧化酶有乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACCα，别称ACCl）和乙酰辅酶A羧化酶p（acetyl-CoA carboxylase beta，ACCp，别称ACC2）2种类型，这2种酶由不同的基因编码，分子量分别为265、280ku。ACCl主要存在于乳腺、脂肪组织和肝脏的细胞液内，由它催化产生的丙二酸单酰辅酶A主要用于合成脂肪酸，是脂肪酸合成时二碳单位的供体；而ACC2主要分布在心脏、肌肉组织和肝脏的线粒体外膜上，由它催化产生的丙二酸单酰辅酶A主要用于调节肉碱棕榈酸穿梭体。有研究表明，敲除ACC2基因的小鼠体内丙二酸单酰辅酶A的含量低，导致脂肪酸的合成减少，氧化分解加快，脂肪组织和肝脏中堆积的脂肪减少，肝糖原含量下降；因此，乙酰辅酶A羧化酶可调节脂肪酸的生物合成和“β-”氧化，影响机体脂肪的代谢、沉积，进而影响背膘厚等肉质性状。然而，现有资料对家畜ACCl的研究多集中在基因多态性与泌乳性能的关联以及基因启动子方面，鲜见ACCl基因表达及其与肉质性状关系的研究；因此，本研究主要对雷公山山区放牧山羊ACCl基因mRNA的组织分布进行探讨，以摸清其组织表达规律，为肉质性状的遗传标记辅助选择积累基础资料。
1.材料与方法
1.1山羊组织样品来源
5～7月龄黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊各取4只（雌、雄各2只），体质量14～17kg，均购自贵州省雷公山山区养羊户处。将山羊放血处死后，迅速提取心、肝、肺、肾、背最长股、半膜肌、皮下脂肪组织，用锡箔纸包裹后投入液氮中。山羊处死前自由进食和饮水。
1.2引物及探针
PCR引物及TaqMan探针根据山羊ACCl及β-actm’基因mRNA序列设计（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成及修饰。探针的5’、3’一分别由FAM（6一羧基荧光素）和TAMRA（6一羧四甲基罗丹明）修饰。
1.3总RNA提取
总RNA提取采用Invitrogen Trizol RNA试剂盒进行。操作简述如下：在约50 mg经液氮速冻的组织样品中加入1mLTrizol溶液，混匀，裂解5min；加入200uL三氯甲烷，剧烈振荡混匀，静置2min；4℃、12000r/min条件下离心15min，吸取上层水相至另一个新的RNase—flee EP管中；加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；4℃、12000r/min条件下离心10min，收集RNA沉淀；用75%乙醇洗涤2次，超净台风干；加入15～60uLRNase-flee水溶解沉淀。
1.4逆转录反应
逆转录反应采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit进行（20uL体系），具体步骤如下：取总量为0.1～2.Oug的总RNA，加RNase—flee H20混匀至14uL，置于65℃下变性5min，冷却；再加5×RTbuffer4uL、逆转录酶1uL、RT引物1uL，于42℃下逆转录18min，然后于98℃下灭活逆转录酶5min；RT完毕岳将cDNA于一20℃下保存，按所需用量稀释备用。
1.5实时荧光定量标准品的制备
PCR反应采用GeneSolution 2×Taq Master Mix（上海硕盟生物科技有限公司）进行，反应体系总体积为20uL，具体操作如下：向O.2 mL PCR管中依次加入RNase—flee H2O7.2uL、2×Taq Master Mix 10uL、10 t～mol/LS—F0.4uL、10umol/Ls—R0.4uL、cDNA 2uL，混匀。热循环参数为：94℃预变性90s；94℃变性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸60s，40个循环；72℃延伸5min。
PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收纯化后，计算目的基因的拷贝数浓度，式中：Ⅳ为目的基因的拷贝数浓度（copies/uL），C为质量浓度（ng/uL），M为扩增片段的碱基对数。经计算，ACCl基因、β-actm基因的拷贝数浓度为1.39×10111、3.53×107copies/uL。 胶回收产物按4倍比例进行5次梯度稀释。稀释后再次测定质量浓度、换算拷贝数浓度，最终得到拷贝数浓度为1.39×10111、3.64×10l10、9.56×109、2.39×109、5.98×108、1.49×108eopies/p=L的ACCl基因连续梯度定量标准品，以及3.53×107、8.82×106、2.21×106、5.51×105、1.38×105、3.45×104copies/uL的β-actm’基因连续梯度定量标准品。
1.6TaqMan PCR
反应在Funglyn FTC-3000实时荧光定量PCR系统（Funglyn Bioteeh，INC，Canada）上进行，每个样品设置3个重复，同时对空白对照及4倍连续梯度标准品进行定量PCR扩增。TaqMan PCR反应体系为20 p=L，其中含2×Realtime PCRMaster Mix 10.0uL、10umol/L前弓l物0.8uL、10umol/L反引物0.8uL、10umol/L TaqMan探针0.4uL、RNase-fleeH20 6.0uL、cDNA模板2.0uL。热循环参数为：95℃预变性10min；每个循环包括95℃变性15 s，63℃退火及延伸60s，40个循环。
1.7统计分析
根据ACCl及β-actu’t基因连续梯度标准品的拷贝数的对数（以4为底）对相应Ct值作图，得到对应基因的定量标准曲线及回归方程。再根据回归方程与样品检测得到的Ct值即可计算出待测样品中ACCl基因及β-actm’基因的拷贝数。ACCl mRNA的个体表达水平以ACCl基因的拷贝数与β-actm’基因的拷贝数之比值表示，平均表达水平以“中位数”表示。
2.结果与分析
雷公山山区放牧的黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊等山羊品种肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪组织中ACCl基因的mRNA表达水平见表2。
从表2可以看出，黔东南小香羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪最高，为3919.545 6，是心（573.7526）、肝（812.0987）、肺（691.6713）、肾（286.0498）、背最长肌（498.7109）和半膜肌（464.938 8）等组织的4.8倍以上；而肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌中ACCl mRNA的表达水平较接近。黔北麻羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪和肺较高，分别为900.5568和900.1608，是心（542.6041）、肝（288.7994）、肾（579.7442）、背最长肌（318.3583）、半膜肌（472.1422）等组织的1.5倍以上。南江黄羊ACCl mRNA的表达水平以皮下脂肪最高，为1550.5592，是心（806.7845）、肝（803.6431）、肺（729.9683）、肾（519.4120）、背最长肌（413.832 6）、半膜肌（260.483 3）等组织的1.9倍以上。贵州黑山羊ACCl mRNA的表达水平在肝脏中最高，为2367.4258，是心（592.7209）、肺（762.8970）、肾（321.6677）、背最长肌（240.0147）、半膜肌（274.9263）、皮下脂肪（328.2781）等组织的3.1倍以上。贵州白山羊ACClmRNA的表达水平以背最长肌（420.11109）、心（351.4361）、半膜肌（268.0311）、肝（200.4141）、肺（110.6160）较高，皮下脂肪（77.4306）和肾（22.8188）较低。
此外，在皮下脂肪中，黔东南小香羊和南江黄羊ACClmRNA的表达水平很高，分别为3 919.5456和1 550.5592；其次是黔北麻羊，为900.5568；贵州黑山羊和贵州白山羊则相对较低，分别为328.2781和77.4306。在肝脏中，贵州黑山羊ACCl mRNA的表达水平最高，为2367.4258；黔东南小香羊和南江黄羊较高，分别为812.098 7和803.6431；黔北麻羊和贵州白山羊相对较低，分别为288.7994和200.4141。
3.结论与讨论
3.1雷公山山区放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝脏中表达
肉质性状作为数量性状，受多基因控制，目前发现的候选基因至少有十几个。ACCl是体内脂肪合成的关键酶之一，参与长链脂肪酸从头合成的第1步反应，对调控肝组织的脂肪代谢活动具有重要作用，是猪屠宰及生产性能的标志。ACCl抑制剂能够抑制小鼠体质量增加，减少小鼠的肥胖程度。因此，检测ACCl mRNA水平能够在转录水平上反映体内脂肪合成能力。本研究对5个品种山羊7种组织ACCl基因的表达进行测试，结果表明，有3个品种（黔东南小香羊、黔北麻羊和南江黄羊）_4CCl基因最主要在皮下脂肪组织中表达，1个品种（贵州黑山羊）主要分布于肝脏，另一品种（贵州白山羊）的优势表达组织器官不明确。这与Barber等的报道较相似：他们认为，哺乳动物中ACCl在所有细胞中表达，但主要在肝脏、脂肪组织以及泌乳期乳腺等脂肪生成组织中表达。本研究结果还显示，在皮下脂肪组织中，黔东南小香羊、黔北麻羊和南江黄羊ACCl mRNA的表达水平个体差异较大，这可能是由于皮下脂肪是ACCl基因表达的最主要组织，外界环境和山羊自身条件的微小变化都能引起ACClmRNA表达水平的较大改变，日粮中的氨基酸、中草药、维生素、金属离子等成分以及饱饿状态等因素都能影响ACCl基因的表达。雷公山山区生态环境优美，气候温和湿润，水质好，植物种类繁多，有“天然药园”之称。该区放牧山羊长期摄食这些植物和草药，不仅为其肌肉生长沉淀丰富的风味物质，而且可以通过影响ACCl基因的转录、翻译而最终影响屠宰性能，最终影响山羊的肉品质量。
3.2ACCl mRNA的表达存在品种差异
就品种分布而言，无论是在表达水平最高的皮下脂肪中，还是在表达水平较高的肝脏中，贵州白山羊ACCl mRNA的表达水平都明显低于其他山羊品种，这从转录层面说明贵州白山羊的肝脏和皮下脂肪组织中丙二酸单酰辅酶A的合成能力较弱，生成的丙二酸单酰辅酶A较少，合成脂肪酸的原料不足，脂肪的合成速率降低，分解加快。Solaiman等也发现，ACCl基因的表达具有品种差异，波尔山羊显著高于Kiko山羊。