论文部分内容阅读
摘 要： 通过分析球红假单胞菌降解褐煤时的煤样粒度、菌液用量、煤浆浓度、转化降解时 间及pH值的变化，研究以上各因素对煤炭微生物转化率的影响。研究结果表明，各因素对煤 炭微生物转化率影响的大小为煤样粒度＞煤浆浓度＞降解时间＞菌液用量。试验条件下，各 因素的最优水平为煤样粒度-0.2 mm、菌液用量10 mL/100 mL、煤浆质量浓度0.9 g/50 mL、 降解时间14 d，此时经硝酸预处理的义马褐煤的煤炭微生物转化率为41.72%； 在整个试验过 程中，培养基pH值是在呈上升的趋势。用XRD和FTIR测试分析了褐煤的微生物转化产物，结 果表明，转化产物的芳香聚合度和分子量有很大程度降低，官能团含量也发生了变化，褐煤 样中的大量芳香类高聚物降解为低分子量类物质及其他类物质。研究为实现煤炭微生物降解 的产业化提供了参考。
关键词：球红假单胞菌；褐煤；生物降解
中图分类号：Q939.99∶TQ530.2 文献 标识码：A 文章编号：1672-1098(2008)03-0046-06
我国褐煤资源储量丰富，但其水分和灰分含量高、热稳定性差、发热量低，这 使褐煤的 利用受限，并造成浪费和环境污染［1］。因此，寻找经济、环保的途径加工处理褐 煤，使褐 煤成为清洁的燃料、化工原料和有特殊价值的化学品是亟待解决的问题［2-3］。
煤的生物转化技术主要是利用微生物实现煤的溶解、液化或气化，从而使煤发生降解［ 4］。[JP1]因生物催化的条件温和、催化剂高度专一，微生物转化技术成为近年来研究的 热点 。褐煤的微生物降解研究始于20世纪80年代。德国Fakoussa［5］和美国Cohen［ 6］发现，某些真菌能在煤块上生长，并能将煤转化为黑色液体。此后，煤的生物转化研 究在世界上引起注意并取得了一定的研究进展［7-9］。国内外研究者已分离出若干 微生物，这些微生物（包括细菌、放线菌、真菌）可降解经氧化处理后的低价煤（氧化状态 ），但其降解能力有限。随着全球石油资源紧缺状况的加剧，筛选新的菌 种并制定出合理的最优工艺路线，实现煤炭的微生物降解具有深远意义。
本文利用球红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroides，简称R.s）对中国河南省义马 褐煤样品进行微生物降解研究。
1 材料与方法
1.1 褐煤及其预处理
[JP1]褐煤含有大量腐植酸和较多水分、灰分。一些金属离子与褐煤中的酸性官能团结合并使 其处于非游离状态，影响煤样微生物转化率。通过酸洗或浸泡可溶解与官能团结合的金属离 子，释放游离羧基并减少结构单元间的交联键，从而有利于褐煤的微生物降解。此外，酸洗 也是褐煤脱硫、脱灰的方法之一［10］。将新采义马褐煤粉碎至所需粒级，使 用浓 度为5 mol/L的硝酸溶液浸泡煤样2 d后，用2XZ-2型旋片式真空 泵过滤煤样并用蒸馏水清洗，直至滤液pH接近7，将煤样烘干、消毒。煤样性质见表1。
1.3 煤炭微生物降解率的测定
取若干150 mL的锥形瓶，分别加入50 mL的液体培养基，高压灭菌 消毒。分别向锥形瓶中加入消毒灭菌后的煤样，将锥形瓶置于恒温振荡培养箱（28 ℃、150 r/min），振荡1 h后静置1 d。调整溶液 pH值约至7.0，加入培养24 h的球红假单胞菌菌液，并在28 ℃、15 0 r/min下恒温振荡培养若干天（根据正交试验参数要求，分别培养7 d、10 d、14 d）后，过滤、离心。向离心得到的上清液中加入 3 mol/L的盐酸（出现絮状沉淀），过滤。将沉淀物在70 ℃下烘干 ，称重并计算煤的微生物降解率η（％）。
方法：以沉淀物（即降解产物）烘干后质量与加入煤样质量之比作为煤的微生物降解率 ［11］，即
1.4 试验方法
采用正交试验，研究煤样粒度A、 菌液用量B、 煤浆浓度C和转化降解时间D各因素对煤 炭 微生物降解率的影响。菌液采用球红假单胞菌培养1 d的液体培养物。 正交试验表头设计采用L9（34）。试验中不考虑各因素间的交互作用，各影响因 素水平见表2。
2 结果与分析
2.1 正交试验结果与分析
球红假单胞菌降解义马褐煤的试验结果见表3；煤样粒度A、菌液用量B、煤浆浓度C和转 化降解时间D与煤炭微生物降解率的关系见图1。
图1 煤炭降解率与其影响因素的关系 由正交试验均值极差R得，试验条件下各因素A、B、C、D的最优水平分别为1、2、2、3 ；最优工艺参数组合为A（1）、B（2）、C（2）、D（3）；各因素对煤的微生物降解率影 响的大小依次为A、B、D、C 。煤样粒度对煤的微生物降解率影响最大，降解时间对煤的 微生物降解率的影响最小。
理论上，煤样粒度越小其比表面积越大，越容易因细菌作用而降解。由图1 a得 ，煤的微生物降解率随煤样粒度的增大呈现近线性降低，－0.2 mm的煤炭的降 解率最大，这是因为随着煤样粒度变小其比表面积急剧增大，煤样与细菌的生化作用界面增 大，从而使煤的微生物降解率快速增高。从实验结果可见于理论完全相符。
随着菌液用量增加，煤的微生物降解率随菌液用量的增加先升高后降低，见图1 b。菌液用量与营养物质的消耗呈正比，菌液用量增加，营养物质的消耗增多，微生物活 性降低，并因营养物质不足而大量死亡，因此，在一定量的培养基含量中菌液用量不能太多 。本实验中出现的于理论相悖的原因可能是因为：由于营养物质的恒定，随着菌液用量的不 同而造成细菌生长周期的变化所引起的。煤浆浓度与降解率的关系与菌液用量相似，见图1 c。究其原因是因为当煤样粒度与菌液用量固定后，煤样过多，作用在单位煤样 上的细菌越少，所以降解率会降低。随着降解时间的增加，煤的微生物降解率增大，见图1 d。7~10 d煤的微生物降解率增长速度比10~14 d的快 ，这是因为随着降解时间的延长，营养物质减少，降解率增长也相应变慢。
2.2 正交试验过程中培养基pH变化及分析
正交试验过程中培养基pH变化：在正交试验过程中，培养基的pH值是变化的，其pH變 化在某种程度上，可能反映出微生物转化煤的机理及转化量的大小。在实验过程中，每隔两 天（部分一天）对培养基pH进行测定，其结果如表4和图2(图中1～9代表试验号)所示。
分析正交试验过程中培养基pH变化，可以大致发现，在整个试验过程中，培养基pH是 在呈上升的趋势。部分样品，在实验初期pH略为下降，这可能是因为煤粒度越大，预处理 时硝酸浸入到其内部，难以用去离子水冲洗掉，故酸性越强，使得培养基pH下降较多。在 整个培养过程中，并不象一些研究者研究的结论：pH升高越大，煤的微生物降解率越高 ［12-13］，而恰恰相反，实验中反映出总的趋势：培养基pH升高越大，其中煤转 化降解越少；培养pH升高较小的，其煤的微生物降解率相对较高。其中的原因有待于后面 的实验进行验证。
3 降解产物的XRD和FTIR研究
3.1 试样及仪器
试验样品1#为义马褐煤微生物转化的水溶物酸沉淀物；2#为义马褐煤微生物转化后的残 渣；3#为硝酸处理后的义马原褐煤。
试验仪器有D/Max-3B型X射线衍射仪（XRD，日本理学Rigaku公司）、VECTOR33型红外 光谱仪（FTIR，德国BRUKER公司）。
3.2 XRD和FTIR测试结果与分析
1#、2#、3#样品的XRD测试结果见图3。由图3可得各樣品层片直径La、微晶层片平均堆砌高度Lc及层片间距d00 2的关系。衍射角/(°)
义马褐煤降解后，水溶物微晶的La、Lc都有相当程度的降低，d002 增大，褐煤水溶物微 晶的层片数减少。这表明煤炭微生物转化的水溶性产物——芳香环单层的芳环缩聚程度降低 ，即芳香环单层层片的堆砌高度降低、芳香环数减少、芳香环层片的芳香结合程度降低，大 分子结构降解。
义马褐煤样经微生物转化前后的FTIR谱图见图4， 其变化趋势基本一致， 在波数3 30 0 cm-1、 1 600 cm-1和1 500 cm-1 附近差 异较大，这为芳烃的—CH与芳环 的骨架振动。图4 c中峰形最强，图4 b中次之， 图4 a中峰形最弱。 图4 c在1 607 cm-1有一中等强度峰， 表明硝酸处理后褐煤的结构单元中含有C＝C或C＝O…HO- 及羧酸的盐类。 褐煤微生物转化的水溶 物酸沉淀物的红外吸收峰中， 1 607 cm-1的峰消失，在1 625 cm-1和1 706 cm-1出现了2个中等强度的峰，1 706 cm-1处为二聚羧酸和羰基，1 625 cm-1处可能是与含氧基共轭 的C＝C和芳香胺；1 353~1 110 cm-1的小峰则表明有酚、醇、醚 、酯存 在（图4a）。这表明义马褐煤样中的大量芳香类高聚物降解为低分子量类物质及其他类物质 。
4 结论
(1) 试验最优工艺参数组合为煤样粒度-0.2 mm、菌液用 量10 mL/1 00 mL、煤浆质量浓度0.9 g/50 mL、降解时间14 d，此时经硝酸预处理的义马褐煤的微生物降解率为41.72%。
(2） 对煤炭微生物降解转化产物的XRD、FTIR测试表明，煤经微生物转化后的水溶性物质 是一种复杂混合物，其芳香聚合度、分子量有很大程度降低，官能团含量也发生了变化，大 量芳香类高聚物降解成低分子量类物质及其他类物质。
(3） 通过对培养过程中培养基pH变化的测试，也可看出，培养基本身pH是增加的，增 加的越大，煤的微生物降解率一般来说，较低一些；而煤的微生物降解率较高的则是在溶煤 过程中pH增加较慢，这也从侧面说明了菌在培养过程中并没有释放出碱性物质来进行溶煤的 。
参考文献：
［1］ 王龙贵,欧泽深.析燃煤污染危害及其防治［J］.选煤技术,2004,1:12-15 .
［2］ POLMAN J K,BRECKENRIDE C R,STONER D L,et al.Biologically derived value-added products from coal［J］.Apple Biotechnol,1995,54(1/2/3):249-255.
［3］ CATCHEAIDE D E A,RALPH J P.Biological processing of coal［J］.Ap pl Microbiol Biotechnol,1999,52(1):16-24.
［4］ 张明旭,王龙贵.煤炭生物转化技术研究及其进展［J］.安徽理工大学学报（ 自然科学版）,2005,12(4):64-65.
［5］ FAKOUSSA R M.Coal a substrate formicroorgan-
ism:investigarion w it h microbial conversion of national coal［D］.Bonn:Friedrich W ilhelms University ,1981.
［6］ COHEN M S,GABRIELE P D.Degradation of coalby the fungi polyporous versicolor and poria placenta［J］.Applied and Environmental Microbia,1982,44 (1):23-27.
［7］ SCOTTC D,STRANDBERG G W,LEWIS S N.Microbial solubilization of coal ［J］.Biotechnology Progress,1986,2(3):131-139.
［8］ FAISON B D,WOODWARD C A,BEAN R M.Microbial solubilization of a pre oxidiz ed subbituminous coal product characterization［J］.Applied Biochemistry and B iotechnology,1990,24(3):831-841.
［9］ RALPH J P,CATCHESIDE D E A.Decolourisation and depolymerisation of solubilised low-rank coalby thewhite-rotbasidiomycet phanerochaete chysospor ium［J］.Appled Microbiol Biotechnology, 1994, 42: 536-543.
［10］ 柳丽芬,阳卫军,成莹.鹤岗风化煤的微生物降解研究［J］.大连理工大 学学报,1996,36(4):434-435.
［11］ 韩威,佟威,杨海波.煤的微生物溶（降）解及其产物研究［J］.大连理 工大学学报,1994,34(6):655-656.
［12］ 武丽敏.微生物降解褐煤的研究［J］.煤炭加工与综合利用,1995,(1): 26-28.
［13］ STRANDBERG G W,LEWIS S L.The solubilization of coal by an Extracellular Product from Streptomyces setonii 75V12［J］.Biotechnology and Bi oengine,1987,1(6):371-375.
(责任编辑：李 丽)
关键词：球红假单胞菌；褐煤；生物降解
中图分类号：Q939.99∶TQ530.2 文献 标识码：A 文章编号：1672-1098(2008)03-0046-06
我国褐煤资源储量丰富，但其水分和灰分含量高、热稳定性差、发热量低，这 使褐煤的 利用受限，并造成浪费和环境污染［1］。因此，寻找经济、环保的途径加工处理褐 煤，使褐 煤成为清洁的燃料、化工原料和有特殊价值的化学品是亟待解决的问题［2-3］。
煤的生物转化技术主要是利用微生物实现煤的溶解、液化或气化，从而使煤发生降解［ 4］。[JP1]因生物催化的条件温和、催化剂高度专一，微生物转化技术成为近年来研究的 热点 。褐煤的微生物降解研究始于20世纪80年代。德国Fakoussa［5］和美国Cohen［ 6］发现，某些真菌能在煤块上生长，并能将煤转化为黑色液体。此后，煤的生物转化研 究在世界上引起注意并取得了一定的研究进展［7-9］。国内外研究者已分离出若干 微生物，这些微生物（包括细菌、放线菌、真菌）可降解经氧化处理后的低价煤（氧化状态 ），但其降解能力有限。随着全球石油资源紧缺状况的加剧，筛选新的菌 种并制定出合理的最优工艺路线，实现煤炭的微生物降解具有深远意义。
本文利用球红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroides，简称R.s）对中国河南省义马 褐煤样品进行微生物降解研究。
1 材料与方法
1.1 褐煤及其预处理
[JP1]褐煤含有大量腐植酸和较多水分、灰分。一些金属离子与褐煤中的酸性官能团结合并使 其处于非游离状态，影响煤样微生物转化率。通过酸洗或浸泡可溶解与官能团结合的金属离 子，释放游离羧基并减少结构单元间的交联键，从而有利于褐煤的微生物降解。此外，酸洗 也是褐煤脱硫、脱灰的方法之一［10］。将新采义马褐煤粉碎至所需粒级，使 用浓 度为5 mol/L的硝酸溶液浸泡煤样2 d后，用2XZ-2型旋片式真空 泵过滤煤样并用蒸馏水清洗，直至滤液pH接近7，将煤样烘干、消毒。煤样性质见表1。
1.3 煤炭微生物降解率的测定
取若干150 mL的锥形瓶，分别加入50 mL的液体培养基，高压灭菌 消毒。分别向锥形瓶中加入消毒灭菌后的煤样，将锥形瓶置于恒温振荡培养箱（28 ℃、150 r/min），振荡1 h后静置1 d。调整溶液 pH值约至7.0，加入培养24 h的球红假单胞菌菌液，并在28 ℃、15 0 r/min下恒温振荡培养若干天（根据正交试验参数要求，分别培养7 d、10 d、14 d）后，过滤、离心。向离心得到的上清液中加入 3 mol/L的盐酸（出现絮状沉淀），过滤。将沉淀物在70 ℃下烘干 ，称重并计算煤的微生物降解率η（％）。
方法：以沉淀物（即降解产物）烘干后质量与加入煤样质量之比作为煤的微生物降解率 ［11］，即
1.4 试验方法
采用正交试验，研究煤样粒度A、 菌液用量B、 煤浆浓度C和转化降解时间D各因素对煤 炭 微生物降解率的影响。菌液采用球红假单胞菌培养1 d的液体培养物。 正交试验表头设计采用L9（34）。试验中不考虑各因素间的交互作用，各影响因 素水平见表2。
2 结果与分析
2.1 正交试验结果与分析
球红假单胞菌降解义马褐煤的试验结果见表3；煤样粒度A、菌液用量B、煤浆浓度C和转 化降解时间D与煤炭微生物降解率的关系见图1。
图1 煤炭降解率与其影响因素的关系 由正交试验均值极差R得，试验条件下各因素A、B、C、D的最优水平分别为1、2、2、3 ；最优工艺参数组合为A（1）、B（2）、C（2）、D（3）；各因素对煤的微生物降解率影 响的大小依次为A、B、D、C 。煤样粒度对煤的微生物降解率影响最大，降解时间对煤的 微生物降解率的影响最小。
理论上，煤样粒度越小其比表面积越大，越容易因细菌作用而降解。由图1 a得 ，煤的微生物降解率随煤样粒度的增大呈现近线性降低，－0.2 mm的煤炭的降 解率最大，这是因为随着煤样粒度变小其比表面积急剧增大，煤样与细菌的生化作用界面增 大，从而使煤的微生物降解率快速增高。从实验结果可见于理论完全相符。
随着菌液用量增加，煤的微生物降解率随菌液用量的增加先升高后降低，见图1 b。菌液用量与营养物质的消耗呈正比，菌液用量增加，营养物质的消耗增多，微生物活 性降低，并因营养物质不足而大量死亡，因此，在一定量的培养基含量中菌液用量不能太多 。本实验中出现的于理论相悖的原因可能是因为：由于营养物质的恒定，随着菌液用量的不 同而造成细菌生长周期的变化所引起的。煤浆浓度与降解率的关系与菌液用量相似，见图1 c。究其原因是因为当煤样粒度与菌液用量固定后，煤样过多，作用在单位煤样 上的细菌越少，所以降解率会降低。随着降解时间的增加，煤的微生物降解率增大，见图1 d。7~10 d煤的微生物降解率增长速度比10~14 d的快 ，这是因为随着降解时间的延长，营养物质减少，降解率增长也相应变慢。
2.2 正交试验过程中培养基pH变化及分析
正交试验过程中培养基pH变化：在正交试验过程中，培养基的pH值是变化的，其pH變 化在某种程度上，可能反映出微生物转化煤的机理及转化量的大小。在实验过程中，每隔两 天（部分一天）对培养基pH进行测定，其结果如表4和图2(图中1～9代表试验号)所示。
分析正交试验过程中培养基pH变化，可以大致发现，在整个试验过程中，培养基pH是 在呈上升的趋势。部分样品，在实验初期pH略为下降，这可能是因为煤粒度越大，预处理 时硝酸浸入到其内部，难以用去离子水冲洗掉，故酸性越强，使得培养基pH下降较多。在 整个培养过程中，并不象一些研究者研究的结论：pH升高越大，煤的微生物降解率越高 ［12-13］，而恰恰相反，实验中反映出总的趋势：培养基pH升高越大，其中煤转 化降解越少；培养pH升高较小的，其煤的微生物降解率相对较高。其中的原因有待于后面 的实验进行验证。
3 降解产物的XRD和FTIR研究
3.1 试样及仪器
试验样品1#为义马褐煤微生物转化的水溶物酸沉淀物；2#为义马褐煤微生物转化后的残 渣；3#为硝酸处理后的义马原褐煤。
试验仪器有D/Max-3B型X射线衍射仪（XRD，日本理学Rigaku公司）、VECTOR33型红外 光谱仪（FTIR，德国BRUKER公司）。
3.2 XRD和FTIR测试结果与分析
1#、2#、3#样品的XRD测试结果见图3。由图3可得各樣品层片直径La、微晶层片平均堆砌高度Lc及层片间距d00 2的关系。衍射角/(°)
义马褐煤降解后，水溶物微晶的La、Lc都有相当程度的降低，d002 增大，褐煤水溶物微 晶的层片数减少。这表明煤炭微生物转化的水溶性产物——芳香环单层的芳环缩聚程度降低 ，即芳香环单层层片的堆砌高度降低、芳香环数减少、芳香环层片的芳香结合程度降低，大 分子结构降解。
义马褐煤样经微生物转化前后的FTIR谱图见图4， 其变化趋势基本一致， 在波数3 30 0 cm-1、 1 600 cm-1和1 500 cm-1 附近差 异较大，这为芳烃的—CH与芳环 的骨架振动。图4 c中峰形最强，图4 b中次之， 图4 a中峰形最弱。 图4 c在1 607 cm-1有一中等强度峰， 表明硝酸处理后褐煤的结构单元中含有C＝C或C＝O…HO- 及羧酸的盐类。 褐煤微生物转化的水溶 物酸沉淀物的红外吸收峰中， 1 607 cm-1的峰消失，在1 625 cm-1和1 706 cm-1出现了2个中等强度的峰，1 706 cm-1处为二聚羧酸和羰基，1 625 cm-1处可能是与含氧基共轭 的C＝C和芳香胺；1 353~1 110 cm-1的小峰则表明有酚、醇、醚 、酯存 在（图4a）。这表明义马褐煤样中的大量芳香类高聚物降解为低分子量类物质及其他类物质 。
4 结论
(1) 试验最优工艺参数组合为煤样粒度-0.2 mm、菌液用 量10 mL/1 00 mL、煤浆质量浓度0.9 g/50 mL、降解时间14 d，此时经硝酸预处理的义马褐煤的微生物降解率为41.72%。
(2） 对煤炭微生物降解转化产物的XRD、FTIR测试表明，煤经微生物转化后的水溶性物质 是一种复杂混合物，其芳香聚合度、分子量有很大程度降低，官能团含量也发生了变化，大 量芳香类高聚物降解成低分子量类物质及其他类物质。
(3） 通过对培养过程中培养基pH变化的测试，也可看出，培养基本身pH是增加的，增 加的越大，煤的微生物降解率一般来说，较低一些；而煤的微生物降解率较高的则是在溶煤 过程中pH增加较慢，这也从侧面说明了菌在培养过程中并没有释放出碱性物质来进行溶煤的 。
参考文献：
［1］ 王龙贵,欧泽深.析燃煤污染危害及其防治［J］.选煤技术,2004,1:12-15 .
［2］ POLMAN J K,BRECKENRIDE C R,STONER D L,et al.Biologically derived value-added products from coal［J］.Apple Biotechnol,1995,54(1/2/3):249-255.
［3］ CATCHEAIDE D E A,RALPH J P.Biological processing of coal［J］.Ap pl Microbiol Biotechnol,1999,52(1):16-24.
［4］ 张明旭,王龙贵.煤炭生物转化技术研究及其进展［J］.安徽理工大学学报（ 自然科学版）,2005,12(4):64-65.
［5］ FAKOUSSA R M.Coal a substrate formicroorgan-
ism:investigarion w it h microbial conversion of national coal［D］.Bonn:Friedrich W ilhelms University ,1981.
［6］ COHEN M S,GABRIELE P D.Degradation of coalby the fungi polyporous versicolor and poria placenta［J］.Applied and Environmental Microbia,1982,44 (1):23-27.
［7］ SCOTTC D,STRANDBERG G W,LEWIS S N.Microbial solubilization of coal ［J］.Biotechnology Progress,1986,2(3):131-139.
［8］ FAISON B D,WOODWARD C A,BEAN R M.Microbial solubilization of a pre oxidiz ed subbituminous coal product characterization［J］.Applied Biochemistry and B iotechnology,1990,24(3):831-841.
［9］ RALPH J P,CATCHESIDE D E A.Decolourisation and depolymerisation of solubilised low-rank coalby thewhite-rotbasidiomycet phanerochaete chysospor ium［J］.Appled Microbiol Biotechnology, 1994, 42: 536-543.
［10］ 柳丽芬,阳卫军,成莹.鹤岗风化煤的微生物降解研究［J］.大连理工大 学学报,1996,36(4):434-435.
［11］ 韩威,佟威,杨海波.煤的微生物溶（降）解及其产物研究［J］.大连理 工大学学报,1994,34(6):655-656.
［12］ 武丽敏.微生物降解褐煤的研究［J］.煤炭加工与综合利用,1995,(1): 26-28.
［13］ STRANDBERG G W,LEWIS S L.The solubilization of coal by an Extracellular Product from Streptomyces setonii 75V12［J］.Biotechnology and Bi oengine,1987,1(6):371-375.
(责任编辑：李 丽)