论文部分内容阅读
目的研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1(TGF-β1)短发夹RNA(shRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC)TGF-β1表达的影响,并与TGF-β1反义RNA对HPMC的作用比较。方法针对TGF-β1的以ggcc开始的21碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pcDNA3.1(-)载体(命名为pcDU6)。2.对DNA双链通过BamHI酶切位点连接后形成中间由6碱基序列间隔的反向互补序列,构建成TGF-β1短发夹RNA的产生质粒。并构建反义TGF-β1基因真核表达载体。采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型。用脂质体转染表达TGF-β1shRNA的pcDU6载体质粒和表达反义TGF-β1RNA的pcDNA3.1(-)的载体质粒导入高糖(4.25%D-葡萄糖)和细菌脂多糖(LPS)刺激下人腹膜间皮细胞。采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量分析HPMC中TGF-β1mRNA的表达以及纤连蛋白(FN)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和胶原Ⅰ(ColⅠ)的mRNA表达。采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMC培养液中TGF-β1蛋白质水平以及FN和PAI-1的蛋白质水平。结果HPMC在高糖和LPS的刺激下可明显上调TGF-β1的表达(P<0.01)。TGF-β1反义RNA转染HPMC24h后,与对照组相比,FN、ColⅠ、PAI-1mRNA分别下调17%、26%、9.6%;转?