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【摘 要】 目的：通过观察金蛭方对缺血性中风大鼠白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，探讨其治疗缺血性中风的作用机制。方法：采用线栓法复制缺血性中风大鼠模型，随机分为假手术组、模型对照组、金蛭方高剂量组、金蛭方低剂量组、阳性药尼莫地平片对照组。测定大鼠血清和脑组织IL-1β、TNF-α的含量。结果：与假手术组比较，缺血性中风大鼠血清及脑组织IL-1β、TNF-α的含量均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，各治疗组均能降低IL-1β、TNF-α的含量（P<0.01）。结论：金蛭方通过调节缺血性中风大鼠IL-1β、TNF-α的分泌和释放以达到拮抗缺血性中风作用。
【关键词】 金蛭方；缺血性中风；白介素-1β；肿瘤坏死因子-α
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）02-0042-03
Abstract：Objective To explore the effects of the Jinzhif，Prescription on ischemic stroke rat interleukin - 1 beta （IL-1）， the effect of the expression of tumor necrosis factor alpha （TNF alpha）， and to explore its mechanism in the treatment of ischemic stroke. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi Prescription high dose group， the Jinzhi Prescription low dose group， positive drug nimodipine tablets in the control group. The contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats were determined. Results Compared with sham operation group， the contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats with ischemic stroke were significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment group could decrease the content of IL-1 and TNFα- （P<0.01）. Conclusion The Jinzhi Prescription through regulation of ischemic stroke rat IL-1， TNF -α secretion and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.
Keywords：Jinzhi Prescription； Lschemic Stroke； Interleukin 1 Beta； Tumor Necrosis Factor Alpha
金蛭方系課题组经过多年筛选出的治疗缺血性中风的效方，临床应用10余年，但其治疗作用机制尚不十分明确。脑缺血后发生脑损害的机制复杂，炎性反应是缺血性脑损害的主要机制之一[1]。在参与炎症反应的众多因子中，最有影响的是IL-lβ和TNF-α[2]。但中药对缺血性中风大鼠IL-1β、TNF-α水平变化影响的报道相对较少。研究旨在通过观察金蛭方对缺血性中风大鼠血清及脑组织IL-1β、TNF-α表达的影响，探讨其治疗缺血性中风的部分作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体重250～300g，由河北省实验动物中心提供，合格证号：1119069。
1.2 药物与试剂 金蛭方组成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由迁安市中医医院制剂室制备），上4味除冰片外水提浓缩成高、低剂量后加入相应研磨冰片，所含生药分别为：0.30g/mL（高剂量）、0.15g/mL（低剂量）。尼莫地平片（国药准字：H41022175，规格：20mg/片，郑州瑞康制药有限公司），按体重0.001g/mL配制成水溶液。IL-1β放射免疫分析试剂盒、TNF-α放射免疫分析试剂盒均由解放军总医院科技开发中心放免研究所提供。
1.3 仪器 FJ-2020型γ射线免疫计数器（国营262厂）；MSE-25型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（泰克仪器有限公司）；F6/10型超细匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司） 。
1.4 造模方法 参考改良的Longa法[3]：颈部正中切口，用3-0手术丝线结扎颈外动脉（ECA）远端及枕动脉，在结扎线距分叉部2mm处剪断ECA，将一端已加工成光滑球形的尼龙线从ECA残端插入进行结扎，将尼龙线经颈总动脉（CCA）[JP+1]分叉部插入颈内动脉（ICA），此时松开CCA，ICA套线恢复血流，线栓推送顺滑，无出血。将线栓向上深入至分叉以上18～19mm达到大脑中动脉开口处，将颈总动脉连同尼龙线一起结扎，缝合切口后外留尼龙线0.5cm，放到单笼中，2h后外拉尼龙线使其球端回至ECA进行缺血后再灌注。 1.5 实验分组与给药[4] 60只大鼠自由进食饮水，饲养于18～22℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，喂养1周后，随机分为5组。假手术组：手术时仅作颈部手术切口，钝性分离颈前肌，游离暴露颈总、颈外、颈内动脉，术后当日灌服蒸馏水。模型对照组（简称模型组）：造模当日灌服蒸馏水。金蛭方低剂量组（简称低剂量组）：造模当日灌服金蛭方，每日用药剂量为1.5 g/kg（相当于成人剂量的10倍）。金蛭方高剂量组（简称高剂量组）：术后当日灌服金蛭方，每日用药剂量为3.0 g/kg （相当于成人剂量的20倍）。阳性药尼莫地平片对照组（简称对照组）：术后当日灌服尼莫地平片，每日用药剂量为0.01 g/kg （相当于成人剂量的20倍）。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1mL/100g计算，连续给药2周。
1.6 检测方法 实验2周末，最后1次给药禁食12h后，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5 mL，注入离心管中待凝固后，4℃ 3000 r/min离心10 min，[JP+1]分离血清，-20℃保存备用。取血后，迅速断头冰浴中取右侧大脑额叶皮层同一位置取脑组织100 g，滤纸吸干血迹，尽快加入预冷的生理盐水碾磨，制成组织匀浆，4℃3000 r/min离心，15 min，取上清液，-20℃保存备用。放免法检测血清及脑组织中TNF- α、IL-1β的含量，具体操作严格遵照试剂盒说明书。
1.7 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料用均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，多组间比较用单因素方差分析和q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
与假手术组比较，模型组大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达显著升高；经用药干预后，各治疗组均能降低大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达 （P<0.01）；其中，高剂量组较低剂量组和对照组大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达降低（P<0.05），低剂量与对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 讨论
课题组通过对中风病临床症候学研究，认为缺血性中风患者多是在气血内虚的基础上，加之劳倦内伤、忧思恼怒、嗜食厚味、烟酒等诱因，导致气血逆乱，直冲犯脑，致气血瘀滞，脑脉痹阻。气滞、血瘀、络阻为本病的主要病机，“气行则血行”，行气、活血、通络为其有效治则组成金蛭方，研制院内制剂“金蛭胶囊”（制剂号：冀药制字Z20051013），治疗缺血性中风10余年，疗效满意。方中水蛭破血逐瘀、通经活络，《本草汇言》曰：“水蛭逐恶血、散瘀血之要药也”；郁金行气活血，化痰降火，《本草汇言》曰：郁金其性清扬，能散郁滞，顺逆气，上达高巅，善行下焦；川芎行气活血，历代医家认为其：“善治中风，治风圣药”[5]；冰片醒神通窍，《本草衍义》曰：“芳香走窜，引药上行，独行则势弱，佐使则有功”，四药合用，共奏活血、化瘀、通络之功。
IL-lβ是最早被发现的神经细胞因子之一，根据其分子结构的不同而有2种类型：IL-Iα和IL-1β，两者的基因结构上有20%～30%的同源性，在许多系统中作用相似，但在脑内以IL-lβ的作用为主。IL-1β在正常中枢神经系统发育和脑对各种损伤的反应中有重要的作用[6]。IL-1β的生物学作用包括刺激其它细胞因子和可溶性损伤介质的合成、诱导白细胞浸润、影响胶质细胞的基因表达等。研究表明，IL-1β可能参与缺血性脑损伤引起的神经元死亡，在缺血性病理损伤中起重要作用[7]。
Carswell等在给接种过卡介苗的小鼠注射脂多糖（LPs）后发现，小鼠血清中出现一种能引起肿瘤出血性坏死的物质，并将其命名为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）。TNF分为TNF-a和TNF-β。TNF-a为一种细胞分泌的蛋白，属于一种前炎症细胞因子[8]，在触发炎症反应中处于中心地位，与IL-1、IL-6和生长因子共同启动，调节大脑局部炎症反应[9]。
研究表明，采用线栓法复制的缺血性中风大鼠模型血清及脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α表达升高，说明IL-1β和TNF-α参与了缺血性中风的发生和发展。经药物干预后，各治疗组可降低大鼠血清及脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α表达，表明金蛭方能调节IL-1β和TNF-α分泌和释放，以达到减轻脑缺血炎症、改善神经功能、预防和治疗缺血性中风的作用，但其具体的作用机制有待进一步深入研究。
参考文献
[1]Amantea D，Nappi G，Bernardi G，et al.Post-ischemic brain damage：pathophysiology and role of inflammatory mediators[J].FEBS J，2009，276（1）：13-26.
[2]孔立，尤可，江涛，等.调气息风法对脑缺血大鼠ICAM-1、IL-1及TNF-α表达的影响[J].中国中医急症，2007，16（9）：1098-1099.
[3]ZeaLonga EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without Craniectomy in Rats[J].Stroke，1989，20（l）：84-91.
[4]AsmarR，MakonnaO，BrisacAM，et al. Comparison between the effects of angiotensin-converting-enzyme inhibitors and angiotens inⅡantagonists [J].Therapie，1998，53（3）：253-270.
[5]陳可冀.瘀血证与活血化瘀源流概述[J].中医杂志，1979，9（1）：51-57.
[6]RothwellNJ.Functional mechanism of IL-1 in the brain[J].Trends Phamacol Sci，1991（12）：4301.
[7]Davies CA， Loddick SA， Toulmond S， et al. The progression and topographic distribution of interleukin-1 expression after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat. J Cereb Blood Flow Metab， 1999， 19（1）： 87-98.
[8]Zarembra J.Contribution of tumbor necrosis faetor a1Pha to the Pathogensis of stroke[J].Foli aMorphol（Warsz），2000，59（3）：137-143.
[9]Yamasaki Y，Itoyama Y，Kogure K.Involvement of cytokine Porduction in Pathogenesis of transient cerebral ischemic damage[J].Keio J Med，1996，45（3）：225-229.
【关键词】 金蛭方；缺血性中风；白介素-1β；肿瘤坏死因子-α
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）02-0042-03
Abstract：Objective To explore the effects of the Jinzhif，Prescription on ischemic stroke rat interleukin - 1 beta （IL-1）， the effect of the expression of tumor necrosis factor alpha （TNF alpha）， and to explore its mechanism in the treatment of ischemic stroke. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi Prescription high dose group， the Jinzhi Prescription low dose group， positive drug nimodipine tablets in the control group. The contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats were determined. Results Compared with sham operation group， the contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats with ischemic stroke were significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment group could decrease the content of IL-1 and TNFα- （P<0.01）. Conclusion The Jinzhi Prescription through regulation of ischemic stroke rat IL-1， TNF -α secretion and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.
Keywords：Jinzhi Prescription； Lschemic Stroke； Interleukin 1 Beta； Tumor Necrosis Factor Alpha
金蛭方系課题组经过多年筛选出的治疗缺血性中风的效方，临床应用10余年，但其治疗作用机制尚不十分明确。脑缺血后发生脑损害的机制复杂，炎性反应是缺血性脑损害的主要机制之一[1]。在参与炎症反应的众多因子中，最有影响的是IL-lβ和TNF-α[2]。但中药对缺血性中风大鼠IL-1β、TNF-α水平变化影响的报道相对较少。研究旨在通过观察金蛭方对缺血性中风大鼠血清及脑组织IL-1β、TNF-α表达的影响，探讨其治疗缺血性中风的部分作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体重250～300g，由河北省实验动物中心提供，合格证号：1119069。
1.2 药物与试剂 金蛭方组成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由迁安市中医医院制剂室制备），上4味除冰片外水提浓缩成高、低剂量后加入相应研磨冰片，所含生药分别为：0.30g/mL（高剂量）、0.15g/mL（低剂量）。尼莫地平片（国药准字：H41022175，规格：20mg/片，郑州瑞康制药有限公司），按体重0.001g/mL配制成水溶液。IL-1β放射免疫分析试剂盒、TNF-α放射免疫分析试剂盒均由解放军总医院科技开发中心放免研究所提供。
1.3 仪器 FJ-2020型γ射线免疫计数器（国营262厂）；MSE-25型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（泰克仪器有限公司）；F6/10型超细匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司） 。
1.4 造模方法 参考改良的Longa法[3]：颈部正中切口，用3-0手术丝线结扎颈外动脉（ECA）远端及枕动脉，在结扎线距分叉部2mm处剪断ECA，将一端已加工成光滑球形的尼龙线从ECA残端插入进行结扎，将尼龙线经颈总动脉（CCA）[JP+1]分叉部插入颈内动脉（ICA），此时松开CCA，ICA套线恢复血流，线栓推送顺滑，无出血。将线栓向上深入至分叉以上18～19mm达到大脑中动脉开口处，将颈总动脉连同尼龙线一起结扎，缝合切口后外留尼龙线0.5cm，放到单笼中，2h后外拉尼龙线使其球端回至ECA进行缺血后再灌注。 1.5 实验分组与给药[4] 60只大鼠自由进食饮水，饲养于18～22℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，喂养1周后，随机分为5组。假手术组：手术时仅作颈部手术切口，钝性分离颈前肌，游离暴露颈总、颈外、颈内动脉，术后当日灌服蒸馏水。模型对照组（简称模型组）：造模当日灌服蒸馏水。金蛭方低剂量组（简称低剂量组）：造模当日灌服金蛭方，每日用药剂量为1.5 g/kg（相当于成人剂量的10倍）。金蛭方高剂量组（简称高剂量组）：术后当日灌服金蛭方，每日用药剂量为3.0 g/kg （相当于成人剂量的20倍）。阳性药尼莫地平片对照组（简称对照组）：术后当日灌服尼莫地平片，每日用药剂量为0.01 g/kg （相当于成人剂量的20倍）。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1mL/100g计算，连续给药2周。
1.6 检测方法 实验2周末，最后1次给药禁食12h后，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5 mL，注入离心管中待凝固后，4℃ 3000 r/min离心10 min，[JP+1]分离血清，-20℃保存备用。取血后，迅速断头冰浴中取右侧大脑额叶皮层同一位置取脑组织100 g，滤纸吸干血迹，尽快加入预冷的生理盐水碾磨，制成组织匀浆，4℃3000 r/min离心，15 min，取上清液，-20℃保存备用。放免法检测血清及脑组织中TNF- α、IL-1β的含量，具体操作严格遵照试剂盒说明书。
1.7 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料用均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，多组间比较用单因素方差分析和q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
与假手术组比较，模型组大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达显著升高；经用药干预后，各治疗组均能降低大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达 （P<0.01）；其中，高剂量组较低剂量组和对照组大鼠血清及脑组织匀浆IL-1β、TNF-α表达降低（P<0.05），低剂量与对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 讨论
课题组通过对中风病临床症候学研究，认为缺血性中风患者多是在气血内虚的基础上，加之劳倦内伤、忧思恼怒、嗜食厚味、烟酒等诱因，导致气血逆乱，直冲犯脑，致气血瘀滞，脑脉痹阻。气滞、血瘀、络阻为本病的主要病机，“气行则血行”，行气、活血、通络为其有效治则组成金蛭方，研制院内制剂“金蛭胶囊”（制剂号：冀药制字Z20051013），治疗缺血性中风10余年，疗效满意。方中水蛭破血逐瘀、通经活络，《本草汇言》曰：“水蛭逐恶血、散瘀血之要药也”；郁金行气活血，化痰降火，《本草汇言》曰：郁金其性清扬，能散郁滞，顺逆气，上达高巅，善行下焦；川芎行气活血，历代医家认为其：“善治中风，治风圣药”[5]；冰片醒神通窍，《本草衍义》曰：“芳香走窜，引药上行，独行则势弱，佐使则有功”，四药合用，共奏活血、化瘀、通络之功。
IL-lβ是最早被发现的神经细胞因子之一，根据其分子结构的不同而有2种类型：IL-Iα和IL-1β，两者的基因结构上有20%～30%的同源性，在许多系统中作用相似，但在脑内以IL-lβ的作用为主。IL-1β在正常中枢神经系统发育和脑对各种损伤的反应中有重要的作用[6]。IL-1β的生物学作用包括刺激其它细胞因子和可溶性损伤介质的合成、诱导白细胞浸润、影响胶质细胞的基因表达等。研究表明，IL-1β可能参与缺血性脑损伤引起的神经元死亡，在缺血性病理损伤中起重要作用[7]。
Carswell等在给接种过卡介苗的小鼠注射脂多糖（LPs）后发现，小鼠血清中出现一种能引起肿瘤出血性坏死的物质，并将其命名为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）。TNF分为TNF-a和TNF-β。TNF-a为一种细胞分泌的蛋白，属于一种前炎症细胞因子[8]，在触发炎症反应中处于中心地位，与IL-1、IL-6和生长因子共同启动，调节大脑局部炎症反应[9]。
研究表明，采用线栓法复制的缺血性中风大鼠模型血清及脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α表达升高，说明IL-1β和TNF-α参与了缺血性中风的发生和发展。经药物干预后，各治疗组可降低大鼠血清及脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α表达，表明金蛭方能调节IL-1β和TNF-α分泌和释放，以达到减轻脑缺血炎症、改善神经功能、预防和治疗缺血性中风的作用，但其具体的作用机制有待进一步深入研究。
参考文献
[1]Amantea D，Nappi G，Bernardi G，et al.Post-ischemic brain damage：pathophysiology and role of inflammatory mediators[J].FEBS J，2009，276（1）：13-26.
[2]孔立，尤可，江涛，等.调气息风法对脑缺血大鼠ICAM-1、IL-1及TNF-α表达的影响[J].中国中医急症，2007，16（9）：1098-1099.
[3]ZeaLonga EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without Craniectomy in Rats[J].Stroke，1989，20（l）：84-91.
[4]AsmarR，MakonnaO，BrisacAM，et al. Comparison between the effects of angiotensin-converting-enzyme inhibitors and angiotens inⅡantagonists [J].Therapie，1998，53（3）：253-270.
[5]陳可冀.瘀血证与活血化瘀源流概述[J].中医杂志，1979，9（1）：51-57.
[6]RothwellNJ.Functional mechanism of IL-1 in the brain[J].Trends Phamacol Sci，1991（12）：4301.
[7]Davies CA， Loddick SA， Toulmond S， et al. The progression and topographic distribution of interleukin-1 expression after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat. J Cereb Blood Flow Metab， 1999， 19（1）： 87-98.
[8]Zarembra J.Contribution of tumbor necrosis faetor a1Pha to the Pathogensis of stroke[J].Foli aMorphol（Warsz），2000，59（3）：137-143.
[9]Yamasaki Y，Itoyama Y，Kogure K.Involvement of cytokine Porduction in Pathogenesis of transient cerebral ischemic damage[J].Keio J Med，1996，45（3）：225-229.