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【摘 要】 目的：研究栀龙凝胶膏贴的水提工艺。方法：以栀子苷的含量为指标，采用正交实验法优选栀龙凝胶膏贴药材的最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为加10倍量体积的水，提取3次，每次60分钟。结论：通过验证，优选出最佳提取工艺稳定可行。
【关键词】 栀龙凝胶膏贴；栀子苷；正交实验设计；高效液相色谱
【中图分类号】R283.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）01-0037-04
Abstract：Objective To study the extraction process of Zhilong paste.Methods The orthogonal experimental method was used to geniposide content to determine the optimum extraction process.Results The results was regarded as the optimal extraction process， that is 10 times of water，3 times of extraction and each for 60 minutes.Conclusion Experiment has been done to prove that the optimum extraction process is stable and feasible.
Keywords：Zhilong Paste；Geniposide；Orthogonal Experiment；HPLC
栀龙散是贵阳中医学院第一附属医院骨科经验方，由栀子、地龙、白芷、泽兰组成，临床用于治疗急性软组织损伤，收效颇佳。中医认为软组织损伤的本质是血瘀，受损之后脉络破损，血液离经而成瘀，血瘀则气滞，瘀血不散则化热，气滞不行则疼痛，所以以活血化瘀，行气止痛为主[1-2]。西医认为急性软组织损伤主要有各种急性外伤或慢性劳损以及自己疾病病理等原因造成人体的皮肤、周围神经血管等组织的病理损害。软组织挫伤多钝性或锐性暴力致伤，包括擦伤、扭伤、挫伤、跌扑伤或撞击伤。栀龙散直接打粉外用，微生物难于控制，临床需要现调配，使用不方便，考虑将栀龙散开发为栀龙凝胶膏贴，本文主要对栀龙凝胶膏贴的水提工艺进行研究，优选最佳工艺，为栀龙凝胶膏贴的质量控制提供基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Aglient-1100HPLC（美国）；Aglient HC-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；双量称电子天平（梅特勒上海有限公司）；202-3A型电热恒温干燥箱（沪南电炉烘箱厂）；电子天平（上海海康电子仪器厂）；电子万用炉（北京市水光明医疗仪器厂）；CH-300超声波清洗器（北京创新超声电子研究所）；HH-S6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。
1.2 材料 栀子苷（批号：110749-200714，中国药品生物制品检定所 ），栀子（批号：20150806）、白芷（批号：20160108）、泽兰（批号：20151104）、地龙（批号：20160407）等药材均购自与贵州省济仁堂药业有限公司。甲醇（批号：20140410，天津市科蜜欧化学试剂有限公司）；乙腈（批号：20140101，天津市科蜜欧化学试剂有限公司），水为娃哈哈纯净水。
2 方法
2.1 栀子苷的含量测定
2.1.1 色谱分析条件 流动相：乙腈∶[KG-*3/5]水（15∶[KG-*3/5]85） 检测波长：238nm。流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量：10μL。
2.1.2 供试品溶液的制备 取处方药材拟按正交设计中实验方法进行提取，提取的药液滤过，浓缩定容至500mL，取10mL的药液，用甲醇定容与100mL容量瓶中摇匀，精密量取续滤液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻线，即得。用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照品溶液的制备 取缺栀子药材的处方拟按正交设计中5号实验方法进行提取，滤过定容。取10mL的滤液，用甲醇定容至100mL容量瓶中摇匀，精密量取续滤液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻线，即得，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为阴性对照品溶液。
2.1.4 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含38μg的溶液，即得。
2.1.5 系统适用性实验 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按2.1.1项下色谱条件进行测定。阴性对照品在对照品及供试品的栀子苷峰位置处无峰出現，表明本法专属性好。色谱如图1所示。
2.1.6 线性关系考察试验 精密称取栀子苷对照品配制成190μg/mL的对照品溶液，稀释成19、38、76、114、152、190 μg/mL注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，进行测定，以进样量x（μg）对峰面积y进行线性回归处理，得到的线性回归方程标准曲线y=1559.2x+11.855，R2=0.9999，结果表明栀子苷在0.19～1.9μg范围内与峰面积的线性关系良好。
2.1.7 精密度的考察 精密量取浓度为38μg/mL的栀子苷对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件，进样测定，进样10μL，连续进样7次，分别测定峰面积，计算其RSD为0.57%，表明仪器精密度良好。
2.1.8 重复性试验 参照2.1.2供试品溶液制备项下制备供试品溶液7份（以正交设计的第5个实验为根据取样），按照2.1.1色谱分析条件项下进行试验，测定样品中栀子苷含量。实验测得栀子苷平均含量为1.42%，RSD为1.76%。 2.1.9 稳定性的考察试验 精密量取已制备好的供试品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，取10μL在0、1、2、4、8、12 h进行进样，测定栀子苷的平均含量1.44%，RSD为2.09%。
2.1.10 加样回收率试验 按栀龙散处方比例称取药材45g 共6份，精密加入一定量的栀子苷对照品，按照正交试验下所确定的工艺进行提取，参照2.1.2供试品溶液制备项下制备供试品溶液6份，按照2.1.1色谱分析条件项下进行试验，测定样品中栀子苷含量。实验测得栀子苷平均回收率在96.2%～102.5%。结果见表1。
2.2 正交实验 采用正交实验法优选栀龙凝胶膏贴药材的最佳提取工艺，以栀子中有效成分栀子苷的提取量作为考察指标，采用高效液相色谱法测定栀子苷的含量。选择3个因素为容积比、提取次数、提取时间，每个因素设3个水平，试验设计方案见表2。正交实验设计及其结果见表3。数据方差分析见表4。
2.3 样品制备 按栀龙散处方比例称取药材90g，共9份，按正交试验设计的方法进行试验，测定其栀子苷的含量，优选最佳的水提工艺。
根据表4可知，RC﹥RA﹥RB，所以在影响栀龙巴布贴的提取浓缩工艺的加水量，煎煮次数，煎煮时间三个因素中，煎煮次数对提取浓缩栀子苷含量的影响最大，加水量对栀子苷含量的也有一定的影响，煎煮的时间影响是最小的。提取次数有显著性的差异，其他两因素的无显著性差异，但对含量也有一定的影响，从栀子苷的含量、经济、生产成本等多因素综合考虑后，得到栀子苷含量的最佳的组合是A2B2C3，即是栀子、泽兰、白芷、地龙4味药材中加入10倍量的水，煎煮3次，每次60min。
2.4 验证实验 根据正交实验结果优选的最优工艺条件A2B2C3，进行3批验证实验，按处方量称取药材，加10倍量水，提取3次，每次60min，结果表明栀子苷的平均含量为1.45%，且重现性好，故认为该工艺稳定可靠。结果见表5。
3 讨论
提取工艺是中药制剂的质量控制中最重要的一个因素[3-5]。一般影响提取工艺的主要因素有煎煮时间、煎煮次数、煎煮用水、煎煮器具、煎煮火候等。本文的研究结果表明，最主要的影响因素是提取次数，对提取本方君药栀子中栀子苷的含量有显著性的差异，其他的影响因素对提取栀子苷有一定的影响，但无显著性差异。
栀龙凝胶膏贴的处方由栀子、地龙、白芷、泽兰组成，栀子为君药，地龙为臣药，白芷和泽兰为使药，本文采用君药栀子中栀子苷的含量为考察指标[6-9]，并制备了缺栀子的阴性进行了比较，在栀子苷峰的位置未见其他峰，说明专属性较好，能较好地为栀龙散研发成栀龙凝胶膏贴的质量控制提供基础。笔者还对提取工艺的方法进行了方法学的验证，实验考察结果表明，此方法洗脱分离度好，重现性佳，且稳定、可靠。 经方法学验证表明，该测定方法稳定可行。
参考文献
[1]葉盛英，杨本明，杜欣，等.中药外用治疗软组织损伤的实验研究进展[J].华北国防医药，2009，21（2）：29-30.
[2]罗洪瑜，苏松柏，张建玲，等.HPLC中测定栀龙散中的栀子苷[J].北方药学，2012，9（6）：1-2.
[3]周贤霞，黄家宇，刘兰，等.赤胫散中总鞣质含量测定及提取工艺优化[J]. 贵州医科大学学报，2017，（6）：1-3.
[4]孟鑫，刘瑶，陈瑞，等.大乌泡根总黄酮提取工艺优选[J].贵州医科大学学报，2016（12）：1411-1414.
[5]印酬，向红霞，王洪凤，等. 贵州不同地区山银花中4种异绿原酸含量测定方法的建立[J].贵州医科大学学报，2016（10）：1176-1180.
[6]孟祥乐，李红伟，李颜，等，栀子化学成分及其药理作用研究进展[J].中国新药杂志， 2011，20（11）：959-960.
[7]何峰，张昀，张艳萍.HPLC法测定栀子提取物中栀子苷的含量[J].贵州医药，2017（3）：245-247.
[8]童红，徐洪，申刚.高效液相色谱法测定益肝草茶中栀子苷的含量[J].贵州医药，2007（3）：269-270.
[9]苏松柏，张永萍，何焜，等.三妙消痛贴的提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，14（16）：9-11.
（收稿日期：2017-11-21 编辑：穆丽华）
【关键词】 栀龙凝胶膏贴；栀子苷；正交实验设计；高效液相色谱
【中图分类号】R283.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）01-0037-04
Abstract：Objective To study the extraction process of Zhilong paste.Methods The orthogonal experimental method was used to geniposide content to determine the optimum extraction process.Results The results was regarded as the optimal extraction process， that is 10 times of water，3 times of extraction and each for 60 minutes.Conclusion Experiment has been done to prove that the optimum extraction process is stable and feasible.
Keywords：Zhilong Paste；Geniposide；Orthogonal Experiment；HPLC
栀龙散是贵阳中医学院第一附属医院骨科经验方，由栀子、地龙、白芷、泽兰组成，临床用于治疗急性软组织损伤，收效颇佳。中医认为软组织损伤的本质是血瘀，受损之后脉络破损，血液离经而成瘀，血瘀则气滞，瘀血不散则化热，气滞不行则疼痛，所以以活血化瘀，行气止痛为主[1-2]。西医认为急性软组织损伤主要有各种急性外伤或慢性劳损以及自己疾病病理等原因造成人体的皮肤、周围神经血管等组织的病理损害。软组织挫伤多钝性或锐性暴力致伤，包括擦伤、扭伤、挫伤、跌扑伤或撞击伤。栀龙散直接打粉外用，微生物难于控制，临床需要现调配，使用不方便，考虑将栀龙散开发为栀龙凝胶膏贴，本文主要对栀龙凝胶膏贴的水提工艺进行研究，优选最佳工艺，为栀龙凝胶膏贴的质量控制提供基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Aglient-1100HPLC（美国）；Aglient HC-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；双量称电子天平（梅特勒上海有限公司）；202-3A型电热恒温干燥箱（沪南电炉烘箱厂）；电子天平（上海海康电子仪器厂）；电子万用炉（北京市水光明医疗仪器厂）；CH-300超声波清洗器（北京创新超声电子研究所）；HH-S6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。
1.2 材料 栀子苷（批号：110749-200714，中国药品生物制品检定所 ），栀子（批号：20150806）、白芷（批号：20160108）、泽兰（批号：20151104）、地龙（批号：20160407）等药材均购自与贵州省济仁堂药业有限公司。甲醇（批号：20140410，天津市科蜜欧化学试剂有限公司）；乙腈（批号：20140101，天津市科蜜欧化学试剂有限公司），水为娃哈哈纯净水。
2 方法
2.1 栀子苷的含量测定
2.1.1 色谱分析条件 流动相：乙腈∶[KG-*3/5]水（15∶[KG-*3/5]85） 检测波长：238nm。流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量：10μL。
2.1.2 供试品溶液的制备 取处方药材拟按正交设计中实验方法进行提取，提取的药液滤过，浓缩定容至500mL，取10mL的药液，用甲醇定容与100mL容量瓶中摇匀，精密量取续滤液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻线，即得。用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照品溶液的制备 取缺栀子药材的处方拟按正交设计中5号实验方法进行提取，滤过定容。取10mL的滤液，用甲醇定容至100mL容量瓶中摇匀，精密量取续滤液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻线，即得，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为阴性对照品溶液。
2.1.4 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含38μg的溶液，即得。
2.1.5 系统适用性实验 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按2.1.1项下色谱条件进行测定。阴性对照品在对照品及供试品的栀子苷峰位置处无峰出現，表明本法专属性好。色谱如图1所示。
2.1.6 线性关系考察试验 精密称取栀子苷对照品配制成190μg/mL的对照品溶液，稀释成19、38、76、114、152、190 μg/mL注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，进行测定，以进样量x（μg）对峰面积y进行线性回归处理，得到的线性回归方程标准曲线y=1559.2x+11.855，R2=0.9999，结果表明栀子苷在0.19～1.9μg范围内与峰面积的线性关系良好。
2.1.7 精密度的考察 精密量取浓度为38μg/mL的栀子苷对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件，进样测定，进样10μL，连续进样7次，分别测定峰面积，计算其RSD为0.57%，表明仪器精密度良好。
2.1.8 重复性试验 参照2.1.2供试品溶液制备项下制备供试品溶液7份（以正交设计的第5个实验为根据取样），按照2.1.1色谱分析条件项下进行试验，测定样品中栀子苷含量。实验测得栀子苷平均含量为1.42%，RSD为1.76%。 2.1.9 稳定性的考察试验 精密量取已制备好的供试品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，取10μL在0、1、2、4、8、12 h进行进样，测定栀子苷的平均含量1.44%，RSD为2.09%。
2.1.10 加样回收率试验 按栀龙散处方比例称取药材45g 共6份，精密加入一定量的栀子苷对照品，按照正交试验下所确定的工艺进行提取，参照2.1.2供试品溶液制备项下制备供试品溶液6份，按照2.1.1色谱分析条件项下进行试验，测定样品中栀子苷含量。实验测得栀子苷平均回收率在96.2%～102.5%。结果见表1。
2.2 正交实验 采用正交实验法优选栀龙凝胶膏贴药材的最佳提取工艺，以栀子中有效成分栀子苷的提取量作为考察指标，采用高效液相色谱法测定栀子苷的含量。选择3个因素为容积比、提取次数、提取时间，每个因素设3个水平，试验设计方案见表2。正交实验设计及其结果见表3。数据方差分析见表4。
2.3 样品制备 按栀龙散处方比例称取药材90g，共9份，按正交试验设计的方法进行试验，测定其栀子苷的含量，优选最佳的水提工艺。
根据表4可知，RC﹥RA﹥RB，所以在影响栀龙巴布贴的提取浓缩工艺的加水量，煎煮次数，煎煮时间三个因素中，煎煮次数对提取浓缩栀子苷含量的影响最大，加水量对栀子苷含量的也有一定的影响，煎煮的时间影响是最小的。提取次数有显著性的差异，其他两因素的无显著性差异，但对含量也有一定的影响，从栀子苷的含量、经济、生产成本等多因素综合考虑后，得到栀子苷含量的最佳的组合是A2B2C3，即是栀子、泽兰、白芷、地龙4味药材中加入10倍量的水，煎煮3次，每次60min。
2.4 验证实验 根据正交实验结果优选的最优工艺条件A2B2C3，进行3批验证实验，按处方量称取药材，加10倍量水，提取3次，每次60min，结果表明栀子苷的平均含量为1.45%，且重现性好，故认为该工艺稳定可靠。结果见表5。
3 讨论
提取工艺是中药制剂的质量控制中最重要的一个因素[3-5]。一般影响提取工艺的主要因素有煎煮时间、煎煮次数、煎煮用水、煎煮器具、煎煮火候等。本文的研究结果表明，最主要的影响因素是提取次数，对提取本方君药栀子中栀子苷的含量有显著性的差异，其他的影响因素对提取栀子苷有一定的影响，但无显著性差异。
栀龙凝胶膏贴的处方由栀子、地龙、白芷、泽兰组成，栀子为君药，地龙为臣药，白芷和泽兰为使药，本文采用君药栀子中栀子苷的含量为考察指标[6-9]，并制备了缺栀子的阴性进行了比较，在栀子苷峰的位置未见其他峰，说明专属性较好，能较好地为栀龙散研发成栀龙凝胶膏贴的质量控制提供基础。笔者还对提取工艺的方法进行了方法学的验证，实验考察结果表明，此方法洗脱分离度好，重现性佳，且稳定、可靠。 经方法学验证表明，该测定方法稳定可行。
参考文献
[1]葉盛英，杨本明，杜欣，等.中药外用治疗软组织损伤的实验研究进展[J].华北国防医药，2009，21（2）：29-30.
[2]罗洪瑜，苏松柏，张建玲，等.HPLC中测定栀龙散中的栀子苷[J].北方药学，2012，9（6）：1-2.
[3]周贤霞，黄家宇，刘兰，等.赤胫散中总鞣质含量测定及提取工艺优化[J]. 贵州医科大学学报，2017，（6）：1-3.
[4]孟鑫，刘瑶，陈瑞，等.大乌泡根总黄酮提取工艺优选[J].贵州医科大学学报，2016（12）：1411-1414.
[5]印酬，向红霞，王洪凤，等. 贵州不同地区山银花中4种异绿原酸含量测定方法的建立[J].贵州医科大学学报，2016（10）：1176-1180.
[6]孟祥乐，李红伟，李颜，等，栀子化学成分及其药理作用研究进展[J].中国新药杂志， 2011，20（11）：959-960.
[7]何峰，张昀，张艳萍.HPLC法测定栀子提取物中栀子苷的含量[J].贵州医药，2017（3）：245-247.
[8]童红，徐洪，申刚.高效液相色谱法测定益肝草茶中栀子苷的含量[J].贵州医药，2007（3）：269-270.
[9]苏松柏，张永萍，何焜，等.三妙消痛贴的提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，14（16）：9-11.
（收稿日期：2017-11-21 编辑：穆丽华）