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【摘 要】目的：探讨土家族药物红刺老苞根皮水提物对类风湿关节炎成纤维滑膜细胞异常增殖的影响。方法：收集1例类风湿关节炎患者的滑膜组织标本，体外培养成纤维滑膜细胞，不同浓度的红刺老苞根皮水提物处理成纤维滑膜细胞48 h后，MTT法检测成其增殖水平，流式细胞术检测其凋亡影响。结果：红刺老苞水提物处理成纤维滑膜细胞后，细胞增殖受到抑制（P < 0.01），并且细胞增殖抑制率与药物含量正相关；而且还能增加成纤维滑膜细胞的细胞凋亡率（P < 0.01）。结论：土家族药物红刺老苞能够抑制成纤维滑膜细胞的异常增殖。
【关键词】 关节炎，类风湿；红刺老苞；成纤维滑膜细胞；体外培养
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一
种以慢性非化脓性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾病。目前对本病的病因病机尚无定论，但是病理研究表明，病变关节出现明显的滑膜增生，其原因主要是成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）数量异常增加和形态改变，侵蚀相邻软骨和骨组织。红刺老苞（Aralia echinocaulis Hand.Mazz.）是湖北土家族地区广泛用于治疗风湿病的民族药。本实验观察红刺老苞水提物对FLSs异常增殖的影响，以探讨其可能作用机制，为更好地开发利用该药物提供实验依据。
1 实验材料
1.1 滑膜组织来源 选取2014年在湖北民族学院附属民大医院行膝关节置换术的男性RA患者1例，
其诊断符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA诊断标准，标本获取已获得患者知情同意。
1.2 主要试剂 红刺老苞根皮（购自湖北民族学院附属民大医院中药房，水煎2次合并药液，过滤浓缩，以注射用水定容至含生药1 g·mL-1，过滤除菌，-20 ℃保存备用）；DMEM培养基（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；噻唑蓝
（MTT，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）。
1.3 主要仪器 倒置显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪（BD公司）；酶标仪（Thermo Fisher公司）；二氧化碳（CO2）培养箱（Thermo Fisher公司）。
2 实验方法
2.1 FLSs的培养及鉴定 将手术中取下的滑膜组织于30 min内在无菌条件下放入培养皿中，剔除脂肪及纤维组织后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗数遍，剪成1 mm3大小的组织块移入无菌培养皿
中；加入含质量分数0.25%的胰酶和2 mg·mL-1的
Ⅱ型胶原蛋白酶混合液消化3～4 h，200目筛过滤，滤液置于1 000 r·min-1离心机离心，弃上清；加入含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞沉淀，移入培养瓶中，在37℃、体积分数5% CO2条件细胞培养箱中培养；等原代细胞生长至70%～80%融合时，按1∶3的比例传代培养，取第4代细胞用于实验。
培养细胞传至第4代时，取FLSs接种于6孔板中进行细胞培养，培养至细胞融合度达80%～90%。用质量分数0.25%的胰酶消化细胞，含血清培养基终止消化。PBS清洗2次后，用抗人CD90+的荧光抗体4 ℃结合30 min。PBS洗2次后，上流式细胞仪检测CD90的表达水平。
2.2 MTT比色法检测红刺老苞水提物对FLSs的增殖抑制作用 取第4代FLSs接种于96孔培养板中，调节细胞悬液含量为每孔6 000个·（100 μL）-1，
每个含量的细胞接种3个复孔；同时用100 mL培养液作空白对照，边缘孔用无菌PBS填充；37 ℃、体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，分别用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释浓度为28.57，14.29，7.15，3.57，1.78，0.89 μg·mL-1（分别为各浓度组），与之共同孵育48 h后，弃上清；每孔加入质量分数0.5%MTT 10 mL，继续培养4 h后，弃培养液；每孔加入150 mL二甲基亚砜，摇床上低速震荡
10 min，酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度OD值。按公式[（1-治疗组OD值/空白组OD值）×100%]计算抑制率。
2.3 流式细胞术检测红刺老苞水提物对FLSs凋亡的影响 取第4代FLSs，接种于6孔板中，37 ℃、
体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，加入用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释含量为10，20 μg·mL-1
（10，20 μg·mL-1浓度组），共培养48 h后，用PBS清洗2次，质量分数0.25%不含EDTA的胰酶消化细胞，移入离心管中，800 r·min-1离心
5 min，弃上清。再严格按照Annexin V/FITC试剂说明书处理后，上流式细胞仪进行分析。
2.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用最小显著差法（LSD）做两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 FLSs培养鉴定 FLSs培养至第4代时，倒置显微镜下可见典型规则梭形细胞，贴壁性好，细胞核边界清晰，未见到其他悬浮细胞。流式细胞仪检测其特征性标记物CD90的表达结果> 99%。
3.2 MTT法 按所用的抑制率公式进行计算，各红刺老苞水提物处理组的增殖抑制率随药物含量增加表现出增长趋势，各处理组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）；组间比较发现，14.29 μg·mL-1浓度组与小药物浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），与28.57 μg·mL-1浓度组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。经直线相关分析药物含量与抑制率间有相关 关系（r = 0.88，P < 0.05），拟合直线回归方程
Y = 0.025 X + 0.207。估计IC50为11.72 μg·mL-1。由此可见红刺老苞水提物对RA FLSs具有增殖抑制作用，且随药物含量的增加而增强；当药物含量超过14.29 μg·mL-1以后，抑制效果达到平台期。
3.3 流式细胞法 通过红刺老苞水提物对FLSs细胞凋亡的影响可以看出，空白对照组在右下象限也表现出一定的自然凋亡率，随着红刺老苞水提物药物含量的增加，在右下象限所显示的凋亡细胞也出现增长的趋势。与空白对照组比较，
10 μg·mL-1浓度组、20 μg·mL-1浓度组的细胞凋亡率差异均有统计学意义（P < 0.01）；20 μg·mL-1
浓度组与10 μg·mL-1浓度组比较，凋亡率明显升高（P < 0.01）。
4 讨 论
根据WHO调查结果显示，全球1%的人患有RA，仅中国患者就达1 000多万。其基本病理改变是滑膜炎，然而由于病因及发病机制尚未完全明了，临床治疗没有特效药物，所以对其病因病机的研究和寻找新的抗RA有效药物一直是风湿病学界长期以来研究的热点[1]。
恩施土家族苗族自治州地处武陵山区，属于云贵川高原的延伸部分，四季日照少，雨雾多，为风湿病的易发地区。然其独特的地理环境特别适合药材的生长，养育了数千种中草药[2]，其中就包含数百种治疗风湿病的土家民族药。红刺老苞属五加科楤木属植物，是恩施常用的土家抗风湿民族药物之一，因其茎皮为紫红色，当地俗称红刺老苞，民间认为其抗风湿作用要好于其他的楤木。《土家族药物志》记载其可以祛风除湿、散瘀消肿，主治风湿性腰腿痛、关节痛等。近几年，笔者等先后用小鼠耳肿胀等常规抗炎实验及迟发性超敏免疫实验进行了红刺老苞的药效学研究，证实了红刺老苞根皮有明显的抗炎镇痛和免疫调节作用[3-4]。乔为平等[5]用贵州的红刺老苞水提物作用于佐剂性关节炎大鼠模型，认为其可以减轻和改善模型大鼠滑膜增生及关节软骨的炎症情况。
在对RA细胞水平的研究中，众多学者一致认为，导致滑膜组织出现炎症的一个重要原因是FLSs的异常增多。滑膜组织包裹在关节外面，在解剖上可分为滑膜内层和滑膜下层，滑膜内层直接和关节腔接触。FLSs就是滑膜内层的主要组成细胞，能大量分泌长链多聚透明质酸、糖蛋白润滑素和纤溶酶原活化因子，以润滑关节腔和阻止关节内纤维粘连，所以正常情况下FLSs对维持关节腔的环境稳态起着重要作用。然而在病理情况下，炎性介质会刺激FLSs产生大量的炎性细胞因子和基质降解酶，加重炎性反应的持续进行；同时异常增多的FLSs还会出现肿瘤样改变，导致关节腔的狭窄甚至关节的损坏[6-7]。现在体外培养FLSs的技术比较成熟[8]。本研究探讨了红刺老苞对RA FLSs异常增殖的影响，实验结果表明，体外培养RA患者FLSs，能表现出异常增殖的能力，其表面特征性标记物CD90的含量可以达到99%以上；用红刺老苞水提物作用48 h，能够明显地抑制RA患者FLSs的增殖，增加其凋亡率，并表现出治疗作用与药物剂量呈正相关。
诱导细胞增殖与凋亡的机制是多方面的，涉及细胞信号传导通路中多种信号传导细胞因子；因
此，对于红刺老苞具体是通过何种信号传导途径来调控RA FLSs异常增殖，还需要进一步深入研究。
5 参考文献
[1] Yamannishi Y，Firestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis：The role of synoviocytes[J].Rheum Arthritis，2001，27（2）：355-368.
[2] 郜红利.湖北恩施地区风湿病治疗用药特色[J].时珍国医国药，2006，17（7）：1317-1318.
[3] 陈国栋，文德鉴.刺茎楤木根皮抗炎镇痛作用的研
究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：997-998.
[4] 肖本见，谭志鑫，梁文梅.刺茎楤木根皮抗炎和免疫作用的研究[J].中国现代应用药学杂志，2006，23（6）：438-440.
[5] 乔为平，乔晓，隋艳华，等.黔棘茎楤木对佐剂性关节炎大鼠治疗作用及机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：165-168.
[6] Noss EH， Brenner MB.The role and therapeutic implications of fibroblsast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev，2008，223（1）：252-270.
[7] 侯亚楠，郭礼和.滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎中的作用[J].细胞生物学杂志，2009，31（2）：157-
162.
[8] 肖楚吟，潘云峰，郭兴华，等.滑膜成纤维细胞的原代培养及生物特性[J].中国医学工程，2010，18（2）：1-4.
收稿日期：2014-08-01；修回日期：2014-10-09
【关键词】 关节炎，类风湿；红刺老苞；成纤维滑膜细胞；体外培养
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一
种以慢性非化脓性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾病。目前对本病的病因病机尚无定论，但是病理研究表明，病变关节出现明显的滑膜增生，其原因主要是成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）数量异常增加和形态改变，侵蚀相邻软骨和骨组织。红刺老苞（Aralia echinocaulis Hand.Mazz.）是湖北土家族地区广泛用于治疗风湿病的民族药。本实验观察红刺老苞水提物对FLSs异常增殖的影响，以探讨其可能作用机制，为更好地开发利用该药物提供实验依据。
1 实验材料
1.1 滑膜组织来源 选取2014年在湖北民族学院附属民大医院行膝关节置换术的男性RA患者1例，
其诊断符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA诊断标准，标本获取已获得患者知情同意。
1.2 主要试剂 红刺老苞根皮（购自湖北民族学院附属民大医院中药房，水煎2次合并药液，过滤浓缩，以注射用水定容至含生药1 g·mL-1，过滤除菌，-20 ℃保存备用）；DMEM培养基（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；噻唑蓝
（MTT，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）。
1.3 主要仪器 倒置显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪（BD公司）；酶标仪（Thermo Fisher公司）；二氧化碳（CO2）培养箱（Thermo Fisher公司）。
2 实验方法
2.1 FLSs的培养及鉴定 将手术中取下的滑膜组织于30 min内在无菌条件下放入培养皿中，剔除脂肪及纤维组织后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗数遍，剪成1 mm3大小的组织块移入无菌培养皿
中；加入含质量分数0.25%的胰酶和2 mg·mL-1的
Ⅱ型胶原蛋白酶混合液消化3～4 h，200目筛过滤，滤液置于1 000 r·min-1离心机离心，弃上清；加入含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞沉淀，移入培养瓶中，在37℃、体积分数5% CO2条件细胞培养箱中培养；等原代细胞生长至70%～80%融合时，按1∶3的比例传代培养，取第4代细胞用于实验。
培养细胞传至第4代时，取FLSs接种于6孔板中进行细胞培养，培养至细胞融合度达80%～90%。用质量分数0.25%的胰酶消化细胞，含血清培养基终止消化。PBS清洗2次后，用抗人CD90+的荧光抗体4 ℃结合30 min。PBS洗2次后，上流式细胞仪检测CD90的表达水平。
2.2 MTT比色法检测红刺老苞水提物对FLSs的增殖抑制作用 取第4代FLSs接种于96孔培养板中，调节细胞悬液含量为每孔6 000个·（100 μL）-1，
每个含量的细胞接种3个复孔；同时用100 mL培养液作空白对照，边缘孔用无菌PBS填充；37 ℃、体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，分别用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释浓度为28.57，14.29，7.15，3.57，1.78，0.89 μg·mL-1（分别为各浓度组），与之共同孵育48 h后，弃上清；每孔加入质量分数0.5%MTT 10 mL，继续培养4 h后，弃培养液；每孔加入150 mL二甲基亚砜，摇床上低速震荡
10 min，酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度OD值。按公式[（1-治疗组OD值/空白组OD值）×100%]计算抑制率。
2.3 流式细胞术检测红刺老苞水提物对FLSs凋亡的影响 取第4代FLSs，接种于6孔板中，37 ℃、
体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，加入用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释含量为10，20 μg·mL-1
（10，20 μg·mL-1浓度组），共培养48 h后，用PBS清洗2次，质量分数0.25%不含EDTA的胰酶消化细胞，移入离心管中，800 r·min-1离心
5 min，弃上清。再严格按照Annexin V/FITC试剂说明书处理后，上流式细胞仪进行分析。
2.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用最小显著差法（LSD）做两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 FLSs培养鉴定 FLSs培养至第4代时，倒置显微镜下可见典型规则梭形细胞，贴壁性好，细胞核边界清晰，未见到其他悬浮细胞。流式细胞仪检测其特征性标记物CD90的表达结果> 99%。
3.2 MTT法 按所用的抑制率公式进行计算，各红刺老苞水提物处理组的增殖抑制率随药物含量增加表现出增长趋势，各处理组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）；组间比较发现，14.29 μg·mL-1浓度组与小药物浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），与28.57 μg·mL-1浓度组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。经直线相关分析药物含量与抑制率间有相关 关系（r = 0.88，P < 0.05），拟合直线回归方程
Y = 0.025 X + 0.207。估计IC50为11.72 μg·mL-1。由此可见红刺老苞水提物对RA FLSs具有增殖抑制作用，且随药物含量的增加而增强；当药物含量超过14.29 μg·mL-1以后，抑制效果达到平台期。
3.3 流式细胞法 通过红刺老苞水提物对FLSs细胞凋亡的影响可以看出，空白对照组在右下象限也表现出一定的自然凋亡率，随着红刺老苞水提物药物含量的增加，在右下象限所显示的凋亡细胞也出现增长的趋势。与空白对照组比较，
10 μg·mL-1浓度组、20 μg·mL-1浓度组的细胞凋亡率差异均有统计学意义（P < 0.01）；20 μg·mL-1
浓度组与10 μg·mL-1浓度组比较，凋亡率明显升高（P < 0.01）。
4 讨 论
根据WHO调查结果显示，全球1%的人患有RA，仅中国患者就达1 000多万。其基本病理改变是滑膜炎，然而由于病因及发病机制尚未完全明了，临床治疗没有特效药物，所以对其病因病机的研究和寻找新的抗RA有效药物一直是风湿病学界长期以来研究的热点[1]。
恩施土家族苗族自治州地处武陵山区，属于云贵川高原的延伸部分，四季日照少，雨雾多，为风湿病的易发地区。然其独特的地理环境特别适合药材的生长，养育了数千种中草药[2]，其中就包含数百种治疗风湿病的土家民族药。红刺老苞属五加科楤木属植物，是恩施常用的土家抗风湿民族药物之一，因其茎皮为紫红色，当地俗称红刺老苞，民间认为其抗风湿作用要好于其他的楤木。《土家族药物志》记载其可以祛风除湿、散瘀消肿，主治风湿性腰腿痛、关节痛等。近几年，笔者等先后用小鼠耳肿胀等常规抗炎实验及迟发性超敏免疫实验进行了红刺老苞的药效学研究，证实了红刺老苞根皮有明显的抗炎镇痛和免疫调节作用[3-4]。乔为平等[5]用贵州的红刺老苞水提物作用于佐剂性关节炎大鼠模型，认为其可以减轻和改善模型大鼠滑膜增生及关节软骨的炎症情况。
在对RA细胞水平的研究中，众多学者一致认为，导致滑膜组织出现炎症的一个重要原因是FLSs的异常增多。滑膜组织包裹在关节外面，在解剖上可分为滑膜内层和滑膜下层，滑膜内层直接和关节腔接触。FLSs就是滑膜内层的主要组成细胞，能大量分泌长链多聚透明质酸、糖蛋白润滑素和纤溶酶原活化因子，以润滑关节腔和阻止关节内纤维粘连，所以正常情况下FLSs对维持关节腔的环境稳态起着重要作用。然而在病理情况下，炎性介质会刺激FLSs产生大量的炎性细胞因子和基质降解酶，加重炎性反应的持续进行；同时异常增多的FLSs还会出现肿瘤样改变，导致关节腔的狭窄甚至关节的损坏[6-7]。现在体外培养FLSs的技术比较成熟[8]。本研究探讨了红刺老苞对RA FLSs异常增殖的影响，实验结果表明，体外培养RA患者FLSs，能表现出异常增殖的能力，其表面特征性标记物CD90的含量可以达到99%以上；用红刺老苞水提物作用48 h，能够明显地抑制RA患者FLSs的增殖，增加其凋亡率，并表现出治疗作用与药物剂量呈正相关。
诱导细胞增殖与凋亡的机制是多方面的，涉及细胞信号传导通路中多种信号传导细胞因子；因
此，对于红刺老苞具体是通过何种信号传导途径来调控RA FLSs异常增殖，还需要进一步深入研究。
5 参考文献
[1] Yamannishi Y，Firestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis：The role of synoviocytes[J].Rheum Arthritis，2001，27（2）：355-368.
[2] 郜红利.湖北恩施地区风湿病治疗用药特色[J].时珍国医国药，2006，17（7）：1317-1318.
[3] 陈国栋，文德鉴.刺茎楤木根皮抗炎镇痛作用的研
究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：997-998.
[4] 肖本见，谭志鑫，梁文梅.刺茎楤木根皮抗炎和免疫作用的研究[J].中国现代应用药学杂志，2006，23（6）：438-440.
[5] 乔为平，乔晓，隋艳华，等.黔棘茎楤木对佐剂性关节炎大鼠治疗作用及机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：165-168.
[6] Noss EH， Brenner MB.The role and therapeutic implications of fibroblsast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev，2008，223（1）：252-270.
[7] 侯亚楠，郭礼和.滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎中的作用[J].细胞生物学杂志，2009，31（2）：157-
162.
[8] 肖楚吟，潘云峰，郭兴华，等.滑膜成纤维细胞的原代培养及生物特性[J].中国医学工程，2010，18（2）：1-4.
收稿日期：2014-08-01；修回日期：2014-10-09