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摘要 [目的]为快速地鉴别鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）和禽腺病毒血清4型（FAdV-4）3种病毒，建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列，设计3对特异性引物，以提取的核酸为模板，进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和 FAdV-4 特异性片段，且不能检出鸭黄病毒（DFV）、鸭 I 型肝炎病毒（DVH-Ⅰ）和禽呼肠孤病毒（ARV）;GPV、MDPV 和 FAdV-4 核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测，可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。
关键词 鹅细小病毒（GPV）;番鸭细小病毒（MDPV）;禽腺病毒4型（FAdV-4）;三重PCR检测
中图分类号 S 855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0183-02
Abstract [Objective]In order to quickly identify three kinds of goose parvovirus （GPV）， muscovy duck parvovlrus （MDPV） and fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）， to establish a triple virus with strong specificity， high sensitivity and good repeatability PCR detection method.[Method]According to the gene sequences of MDPV， GPV and FAdV4 registered in Genbank， 3 pairs of specific primers were designed and the extracted nucleic acid was used as a template to perform PCR specificity， sensitivity and repeatability tests.[Result]The established method could amplify specific fragments of GPV， MDPV and FAdV4， and cannot detect duck flavivirus （DFV）， duck viral hepatitis typeⅠ（DVHⅠ） and avian reovirus （ARV）.The minimum detection levels of GPV， MDPV and FAdV4 nucleic acid templates were 20， 2 and 2 pg， respectively.The detection of 8 positive clinical materials showed that the detection rates of MDPV， GPV and FAdV4 were all 100%.[Conclusion] The established triple PCR detection method can quickly and accurately diagnose the three viruses MDPV， GPV and FAdV4.
Key words Goose parvovirus （GPV）;Muscovy duck parvovlrus （MDPV）;Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）;Triplex PCR detection
基金项目 安徽省科技重大专项（202003a06020012）;安徽省畜禽疫病研究中心项目（2020YL094）;安徽省家禽产业技术体系（AHCYJSTX-06）。
作者简介 戴银（1980—），女，安徽蒙城人，副研究员，博士，从事兽医微生物与免疫学研究。*通信作者，研究员，从事畜禽传染病学研究。
收稿日期 2020-10-10;修回日期 2021-01-28
番鸭细小病毒（muscovy duck parvovlrus，MDPV）和鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）都是细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属成员[1]。MDPV可引起雏番鸭的细小病毒病，又称番鸭3周病，该病具有高度的传染性，主要导致雏番鸭消化道、肠道等部位的病变，发病率和死亡率较高[2-3]。GPV又称小鹅瘟，是一种急性或亚急性败血性传染病，传播速度快[4];该病以肠道的病变为主要特征，主要侵害20日龄以下雏鹅，也可感染雏番鸭，发病率、死亡率可高达100%[5]。禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病源[6]。血清4 型I 群禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）可引起以心包积液，以及包涵体肝炎为特征的心包积水-肝炎综合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），病禽主要表现在精神沉郁、扭头等神经症状，死亡率可达20%～30%[7]。
GPV和MDPV基因组具有高度的同源性，抗原性也高度相似，用常规的血清学检测方法很难区分。FAdV也可分为5个种、12个血清型，其中以血清4型为主[8]。相对酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、免疫荧光技术等方法，PCR方法则可同时对多个病毒进行准确、快速的鉴别诊断。三重 PCR 实现了一管三检的目的，具有成本低、效率高、速度快等优点。目前，应用三重PCR 技术同时对GPV、MDPV和FAdV-4的3种病毒进行检测和诊断的研究鲜见报道，该研究设计了3對特异性引物，建立了GPV、MDPV和FAdV-4的三重 PCR 快速检测方法。 1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
DL2000 DNA Marker、Taq酶等购自宝生物工程（大连）有限公司;RNA/DNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒、琼脂糖（电泳纯）等购自生工生物工程科技（上海）股份有限公司。
1.2 病毒株
GPV、MDPV和FAdV-4，以及对照毒株鸭黄病毒（duck flavivirus，DFV）、鸭 I 型肝炎病毒（duck viral hepatitis type Ⅰ，DVH-Ⅰ）和禽呼肠孤病毒（avian reovirus，ARV）由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存。
1.3 三重PCR方法的建立
1.3.1 引物的设计与合成。根据GPV、MDPV和 FAdV-4的基因保守序列，用Primer Premier 5.0软件设计3对特异性扩增引物（表1），由生工生物工程科技（上海）股份有限公司合成。
1.3.2 核酸的提取及反转录。根据病毒 DNA/RNA 快速提取试剂盒说明书，提取GPV、MDPV、 FAdV-4、DFV、DVH-Ⅰ和ARV的 DNA/RNA。核酸蛋白测定仪测定核酸的浓度和纯度，于-20 ℃保存备用。将RNA 按反转录试剂盒说明书反转录成 cDNA。
1.3.3 PCR反应条件。PCR反应体系：DNA 1 μL，上、下游引物各1.0 μL， Taq DNA 聚合酶Mixture 14 μL，ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 特异性检测
把含有GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的样品，以及含有其他对照病原体（DFV、DVH-Ⅰ和ARV）的核酸样品，分别加至GPV、MDPV和 FAdV-4的三重PCR反应体系中进行扩增，以检测其特异性。
1.5 敏感性检测
测定GPV、MDPV和 FAdV-4的核酸模板浓度后，将其作10倍递进稀释至10-7。分别对上述模板进行三重PCR扩增，以检测其敏感性。
1.6 重复性检测
利用建立的三重PCR方法，在相同条件下，对收集的8份已鉴定的禽病料进行基因组提取和PCR扩增检测，以验证该PCR方法的重复性。
1.7 PCR产物的电泳分析及克隆测序
取5 μL PCR产物于上样孔中，同时点DNA Marker作为参照，以90～120 V的电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，在紫外凝胶成像仪上观察结果，分析并记录。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 三重PCR的特异性
采用该方法对GPV、MDPV和 FAdV-4及对照病原体DFV、DVH-Ⅰ和ARV的核酸样品进行检测，结果发现（图1），GPV、MDPV和 FAdV-4的混合核酸模板及单独模板均能扩增出与试验设计大小相符的628、432、979 bp的条带，而对照病原体在相同位置却无特异性扩增条带。
2.2 三重PCR的敏感性
经敏感性试验测定，结果发现（图2），GPV、MDPV和 FAdV-4三重PCR 最低能同时检测到2 pg的MDPV和 FAdV-4核酸模板以及20 pg GPV核酸模板。
2.3 三重PCR的重复性
利用建立的三重PCR方法，对已鉴定的病料进行检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示（图3），8份混合核酸模板的PCR扩增结果均出现了3条清晰明亮的目的条带。结果表明，建立的GPV、MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法具有良好的重复性。
3 讨论与结论
番鸭细小病毒（MDPV）只感染番鸭，鹅细小病毒（GPV）则既可感染鹅，又可感染番鸭，新型鹅细小病毒还可导致鸭的短喙和侏儒综合征[9-10];研究发现MDPV和GPV在自然环境中可发生基因重组，形成重组型的水禽细小病毒株[11-13]，产生新的危害。禽腺病毒血清4型（FAdV-4）不仅在鸡群中造成危害，也可感染鹅和鸭[14-15]，但目前还未引起广泛的重视。这3种病毒病近年来不断有发生的报道，已成为危害水禽养殖业的重要病原，建立准确、快速的检测方法尤为重要。相对常规血清学方法，PCR方法具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，多重PCR则可一次同时检测多种病毒，更为简便、快速。
由于多重PCR反应体系中存在2种以上的引物和模板，反应过程中相互之间可能会存在一定的干扰，因此要求各引物要有较强的特异性，且反应条件尽可能地接近一致。该研究根据GPV、MDPV和FAdV-4各自的基因组序列设计多对特异性引物，通过多次反应条件的优化，筛选了退火温度一致的3对引物，进行一次PCR扩增，即可鉴别GPV、MDPV和FAdV-4这3种病毒。采用该三重PCR 方法，GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的最低检出量分别为20、2和2 pg;对8份临床病料进行检测，发现MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。这说明该三重 PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可为鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒鉴别诊断提供准确的结果，对3种疫病的预防控制具有重要意义。
参考文献
[1] 万春和，陈红梅，傅秋玲，等.番鸭细小病毒浙江分离株 VP 基因的克隆与序列分析[J].中国畜牧兽医，2015，42（10）：2600-2605.
[2] 戴银，张丹俊，沈学怀，等.安徽番鸭细小病毒的分離和PCR检测[J].中国兽医杂志，2016，52（8）：35-37. [3] 崔国杰，陈少莺.番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒混合感染的诊治[J].畜牧与兽医，2015，47（3）：147-148.
[4] 黄宇翔，刘力威，李洪彬，等.鹅细小病毒病、副黏病毒病的流行病学调查及病原分离鉴定[J].中国家禽，2013，35（2）：22-25，29.
[5] 吴娟，卢梁萍，戴银，等.番鸭细小病毒病和鹅细小病毒病的特征和防控[J].畜牧与饲料科学，2017，38（8）：100-102.
[6] 卢凤英，孙华伟，张敬峰，等.鸭源血清4型禽腺病毒的分离鉴定[J].中国家禽，2018，40（5）：62-64.
[7] 孙自若，林维鹏，杨晓龙，等.血清4型禽腺病毒研究进展[J].中国家禽，2018，40（16）：43-49.
[8] 王慧，程小果，陈申秒.I亚群禽腺病毒流行新特点及防控策略[J].家禽科学，2017（2）：23-25.
[9] 宫晓华，李琦，李傳峰，等.鸭源新型鹅细小病毒DS15株生物学特性研究[J].中国家禽，2017，39（4）：52-55.
[10] LI C F，LI Q，CHEN Z Y，et al.Novel duck parvovirus identified in Cherry Valley ducks（ Anas platyrhynchos domesticus ），China[J].Infect Genet Evol，2016，44：278-280.
[11] WANG J Y，LING J Y，WANG Z X，et al.Molecular characterization of a novel Muscovy duck parvovirus isolate：Evidence of recombination between classical MDPV and goose parvovirus strains[J].BMC Vet Res，2017，13（1）：1-10.
[12] ZHU Y，ZHOU Z，HUANG Y，et al.Identification of a recombinant Muscovy Duck parvovirus（MDPV）in Shanghai，China [J].Vet Microbiol，2014，174（3/4）：560-564.
[13] 万春和，傅秋玲，陈翠腾，等.基因重组型番鸭细小病毒FJM3的全基因组特征[J].中国兽医学报，2016，36（11）：1836-1841.
[14] 粟元文，王怀禹，魏玲.鸭源FadV-4的分离鉴定与致病性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2019（4）：98-101.
[15] 卢凤英，孙华伟，张敬峰，等.鸭源血清4型禽腺病毒的分离鉴定[J].中国家禽，2018，40（5）：62-64.
关键词 鹅细小病毒（GPV）;番鸭细小病毒（MDPV）;禽腺病毒4型（FAdV-4）;三重PCR检测
中图分类号 S 855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0183-02
Abstract [Objective]In order to quickly identify three kinds of goose parvovirus （GPV）， muscovy duck parvovlrus （MDPV） and fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）， to establish a triple virus with strong specificity， high sensitivity and good repeatability PCR detection method.[Method]According to the gene sequences of MDPV， GPV and FAdV4 registered in Genbank， 3 pairs of specific primers were designed and the extracted nucleic acid was used as a template to perform PCR specificity， sensitivity and repeatability tests.[Result]The established method could amplify specific fragments of GPV， MDPV and FAdV4， and cannot detect duck flavivirus （DFV）， duck viral hepatitis typeⅠ（DVHⅠ） and avian reovirus （ARV）.The minimum detection levels of GPV， MDPV and FAdV4 nucleic acid templates were 20， 2 and 2 pg， respectively.The detection of 8 positive clinical materials showed that the detection rates of MDPV， GPV and FAdV4 were all 100%.[Conclusion] The established triple PCR detection method can quickly and accurately diagnose the three viruses MDPV， GPV and FAdV4.
Key words Goose parvovirus （GPV）;Muscovy duck parvovlrus （MDPV）;Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）;Triplex PCR detection
基金项目 安徽省科技重大专项（202003a06020012）;安徽省畜禽疫病研究中心项目（2020YL094）;安徽省家禽产业技术体系（AHCYJSTX-06）。
作者简介 戴银（1980—），女，安徽蒙城人，副研究员，博士，从事兽医微生物与免疫学研究。*通信作者，研究员，从事畜禽传染病学研究。
收稿日期 2020-10-10;修回日期 2021-01-28
番鸭细小病毒（muscovy duck parvovlrus，MDPV）和鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）都是细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属成员[1]。MDPV可引起雏番鸭的细小病毒病，又称番鸭3周病，该病具有高度的传染性，主要导致雏番鸭消化道、肠道等部位的病变，发病率和死亡率较高[2-3]。GPV又称小鹅瘟，是一种急性或亚急性败血性传染病，传播速度快[4];该病以肠道的病变为主要特征，主要侵害20日龄以下雏鹅，也可感染雏番鸭，发病率、死亡率可高达100%[5]。禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病源[6]。血清4 型I 群禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）可引起以心包积液，以及包涵体肝炎为特征的心包积水-肝炎综合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），病禽主要表现在精神沉郁、扭头等神经症状，死亡率可达20%～30%[7]。
GPV和MDPV基因组具有高度的同源性，抗原性也高度相似，用常规的血清学检测方法很难区分。FAdV也可分为5个种、12个血清型，其中以血清4型为主[8]。相对酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、免疫荧光技术等方法，PCR方法则可同时对多个病毒进行准确、快速的鉴别诊断。三重 PCR 实现了一管三检的目的，具有成本低、效率高、速度快等优点。目前，应用三重PCR 技术同时对GPV、MDPV和FAdV-4的3种病毒进行检测和诊断的研究鲜见报道，该研究设计了3對特异性引物，建立了GPV、MDPV和FAdV-4的三重 PCR 快速检测方法。 1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
DL2000 DNA Marker、Taq酶等购自宝生物工程（大连）有限公司;RNA/DNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒、琼脂糖（电泳纯）等购自生工生物工程科技（上海）股份有限公司。
1.2 病毒株
GPV、MDPV和FAdV-4，以及对照毒株鸭黄病毒（duck flavivirus，DFV）、鸭 I 型肝炎病毒（duck viral hepatitis type Ⅰ，DVH-Ⅰ）和禽呼肠孤病毒（avian reovirus，ARV）由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存。
1.3 三重PCR方法的建立
1.3.1 引物的设计与合成。根据GPV、MDPV和 FAdV-4的基因保守序列，用Primer Premier 5.0软件设计3对特异性扩增引物（表1），由生工生物工程科技（上海）股份有限公司合成。
1.3.2 核酸的提取及反转录。根据病毒 DNA/RNA 快速提取试剂盒说明书，提取GPV、MDPV、 FAdV-4、DFV、DVH-Ⅰ和ARV的 DNA/RNA。核酸蛋白测定仪测定核酸的浓度和纯度，于-20 ℃保存备用。将RNA 按反转录试剂盒说明书反转录成 cDNA。
1.3.3 PCR反应条件。PCR反应体系：DNA 1 μL，上、下游引物各1.0 μL， Taq DNA 聚合酶Mixture 14 μL，ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 特异性检测
把含有GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的样品，以及含有其他对照病原体（DFV、DVH-Ⅰ和ARV）的核酸样品，分别加至GPV、MDPV和 FAdV-4的三重PCR反应体系中进行扩增，以检测其特异性。
1.5 敏感性检测
测定GPV、MDPV和 FAdV-4的核酸模板浓度后，将其作10倍递进稀释至10-7。分别对上述模板进行三重PCR扩增，以检测其敏感性。
1.6 重复性检测
利用建立的三重PCR方法，在相同条件下，对收集的8份已鉴定的禽病料进行基因组提取和PCR扩增检测，以验证该PCR方法的重复性。
1.7 PCR产物的电泳分析及克隆测序
取5 μL PCR产物于上样孔中，同时点DNA Marker作为参照，以90～120 V的电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，在紫外凝胶成像仪上观察结果，分析并记录。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 三重PCR的特异性
采用该方法对GPV、MDPV和 FAdV-4及对照病原体DFV、DVH-Ⅰ和ARV的核酸样品进行检测，结果发现（图1），GPV、MDPV和 FAdV-4的混合核酸模板及单独模板均能扩增出与试验设计大小相符的628、432、979 bp的条带，而对照病原体在相同位置却无特异性扩增条带。
2.2 三重PCR的敏感性
经敏感性试验测定，结果发现（图2），GPV、MDPV和 FAdV-4三重PCR 最低能同时检测到2 pg的MDPV和 FAdV-4核酸模板以及20 pg GPV核酸模板。
2.3 三重PCR的重复性
利用建立的三重PCR方法，对已鉴定的病料进行检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示（图3），8份混合核酸模板的PCR扩增结果均出现了3条清晰明亮的目的条带。结果表明，建立的GPV、MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法具有良好的重复性。
3 讨论与结论
番鸭细小病毒（MDPV）只感染番鸭，鹅细小病毒（GPV）则既可感染鹅，又可感染番鸭，新型鹅细小病毒还可导致鸭的短喙和侏儒综合征[9-10];研究发现MDPV和GPV在自然环境中可发生基因重组，形成重组型的水禽细小病毒株[11-13]，产生新的危害。禽腺病毒血清4型（FAdV-4）不仅在鸡群中造成危害，也可感染鹅和鸭[14-15]，但目前还未引起广泛的重视。这3种病毒病近年来不断有发生的报道，已成为危害水禽养殖业的重要病原，建立准确、快速的检测方法尤为重要。相对常规血清学方法，PCR方法具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，多重PCR则可一次同时检测多种病毒，更为简便、快速。
由于多重PCR反应体系中存在2种以上的引物和模板，反应过程中相互之间可能会存在一定的干扰，因此要求各引物要有较强的特异性，且反应条件尽可能地接近一致。该研究根据GPV、MDPV和FAdV-4各自的基因组序列设计多对特异性引物，通过多次反应条件的优化，筛选了退火温度一致的3对引物，进行一次PCR扩增，即可鉴别GPV、MDPV和FAdV-4这3种病毒。采用该三重PCR 方法，GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的最低检出量分别为20、2和2 pg;对8份临床病料进行检测，发现MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。这说明该三重 PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可为鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒鉴别诊断提供准确的结果，对3种疫病的预防控制具有重要意义。
参考文献
[1] 万春和，陈红梅，傅秋玲，等.番鸭细小病毒浙江分离株 VP 基因的克隆与序列分析[J].中国畜牧兽医，2015，42（10）：2600-2605.
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[13] 万春和，傅秋玲，陈翠腾，等.基因重组型番鸭细小病毒FJM3的全基因组特征[J].中国兽医学报，2016，36（11）：1836-1841.
[14] 粟元文，王怀禹，魏玲.鸭源FadV-4的分离鉴定与致病性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2019（4）：98-101.
[15] 卢凤英，孙华伟，张敬峰，等.鸭源血清4型禽腺病毒的分离鉴定[J].中国家禽，2018，40（5）：62-64.