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摘要：目的 研究CXCR4、CTGF、MMP1、IL11、MST1R、ETV1 6种基因在鼻咽癌细胞58F与骨共培养前后的表达情况，分析这些基因在鼻咽癌骨转移中的作用。方法 采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RTPCR检测58F细胞与骨共培养前后骨转移相关基因的表达情况。结论 实时荧光定量RTPCR能够敏感、特异地检测出鼻咽癌细胞在与骨组织共培养前后的mRNA的表达变化，方法准确可靠，操作方便；CXCR4、CTGF、MST1R、ETV1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的潜在标志物。
关键词：荧光定量RTPCR；骨转移相关基因；鼻咽癌
骨转移是晚期恶性肿瘤的常见并发症，近年来逐渐成为肿瘤转移机制研究领域的热点之一，在骨转移的发生过程中，由于骨组织微环境与肿瘤细胞的相互作用，使得肿瘤细胞具有特定的基因型。趋化因子受体、结缔组织生长因子、基质金属蛋白酶1、白细胞介素11是乳腺癌骨转移的标签基因；巨噬细胞刺激蛋白受体在乳腺癌骨转移中发挥作用；而ETV1 则在前列腺癌的骨转移中表达增高。
1 材料与方法
1.1 细胞
鼻咽癌细胞株58F为本实验室冻存，低分化人鼻咽癌细胞株，细胞均呈上皮样，贴壁生长，生长培基为含有10%（φ）新生牛血清的RPMI1640。
1.2 共培养实验
从裸鼠取前肢骨和后肢骨，去除骨周围的肌肉，沿长轴切开骨干，使骨髓腔暴露，切成0.8 cm长的骨块置于含有抗生素的BGJb培养基中，37 ℃平衡24 h后，将3～5块骨组织加入到生长有58F细胞的T25培养瓶中，与58F细胞进行共培养，培养基为含抗生素和5%胎牛血清的BGJb和RPMI1640（体积比1∶1）混合培养基，连续培养24 h。
1.3 RNA抽提 共培养结束24 h后，弃去骨组织，Dhank’s冲洗58F细胞3次，加入1 mL Trizol 裂解液，冰上5 min，加入200 μL氯仿振荡混匀，4 ℃，12 000 g，离心15 min，吸取上清液至另一灭菌Ep 管内，加入等体积异丙醇，室温沉淀10 min后，4 ℃，12 000 g，离心10 min，弃尽上清，加入1 mL 75 %酒精（φ）洗涤沉淀，4 ℃ 12 000g，5 min，弃尽上清，室温干燥1～3 min，加入20 μL 1‰焦碳酸二乙酯处理水溶解。
1.4 荧光定量RTPCR的检测 反应体积为20 μL，反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，上游引物F（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物R（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL；以βactin为内参。反应条件为：（1）预变性95 ℃ 60 s（2）95 ℃ 5 s，61/55/52/60/57/55 ℃（CXCR4/CTGF/MMP1/IL11/MST1R/ ETV1）15 s，72 ℃ 5 s共45 个循环（3）95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。
1.5 统计学处理
计量数据以±s表示，用SPSS 11.5软件对未处理样本（共培养前58F）与处理样本（共培养后58F）的ΔCt进行两独立样本的t检验（双侧）分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 FQPCR检测58F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的扩增曲线 见图1。（略）
2.2 FQPCR检测58F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的熔解曲线 见图2。（略）
从熔解曲线图中可以看到，βactin熔解温度为89 ℃，不同的基因产物对应不同的熔解温度；在不同样本中，同一基因产物的熔解温度大致相同，证明所扩增的产物特异性较好。
2.3 6种基因在鼻咽癌细胞58F与骨组织共培养前后的表达差异FQPCR中，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，反之，Ct值就越大。在相对定量分析中，将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减，所得出的ΔCt为目的基因相对于内参基因的表达强度，即ΔCt=目的基因Ct内参基因Ct。再使用2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示，-ΔΔCt=-（ΔCt处理样本-ΔCt未处理样本）。2-ΔΔCt>1，目的基因表达上调，反之下调。
3 讨论
骨转移是多种恶性肿瘤晚期的一个共同而又常见的临床表现，可以引起局部剧烈疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等神经症状，严重影响患者的生存质量，通常难以治愈。因此，探索鼻咽癌骨转移的分子机制，对于诊断鼻咽癌骨转移、判断预后以及探索新的治疗策略具有重要意义。
采用SYBR GreenⅠ的FQPCR技术对靶基因进行实时荧光定量分析是近年来发展起来的一项新技术。SYBR GreenⅠ是一种能与双链DNA结合的荧光染料，根据检测出的荧光信号强度可以确定出PCR体系中存在的双链DNA数量，并且通过熔解曲线的分析，排除非特异性扩增的干扰，对靶基因进行定量分析，准确性和灵敏性都比普通RTPCR高。2-ΔΔCt计算方法能够很好地分析靶基因表达的相对差异，该方法无需做标准曲线，比绝对定量方法更加简便可行。
利用肿瘤细胞与骨组织共培养的模型来模拟骨组织微环境对肿瘤细胞的影响。结果显示：58F细胞与骨组织共培养后，肿瘤细胞中CXCR4的表达较共培养前上调3.43倍，CTGF上调1.82倍，MST1R上调23.10倍，ETV1上调2.00倍，这些基因通过化学趋化、促进血管生成、降解细胞外基质等一系列作用，促使鼻咽癌细胞更适合在骨组织中的生长，从而促使骨转移的发生。因此，CXCR4、CTGF、MST1R、ETV1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的标签基因。
参考文献：
[1]李静 实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织骨桥蛋白的表达 临床医学杂志 2012，1（9）：67
[2]王军 实时荧光定量PRC检测鼻咽癌骨转移相关基因的分析 健康之路杂志 2012，2（1）：87
关键词：荧光定量RTPCR；骨转移相关基因；鼻咽癌
骨转移是晚期恶性肿瘤的常见并发症，近年来逐渐成为肿瘤转移机制研究领域的热点之一，在骨转移的发生过程中，由于骨组织微环境与肿瘤细胞的相互作用，使得肿瘤细胞具有特定的基因型。趋化因子受体、结缔组织生长因子、基质金属蛋白酶1、白细胞介素11是乳腺癌骨转移的标签基因；巨噬细胞刺激蛋白受体在乳腺癌骨转移中发挥作用；而ETV1 则在前列腺癌的骨转移中表达增高。
1 材料与方法
1.1 细胞
鼻咽癌细胞株58F为本实验室冻存，低分化人鼻咽癌细胞株，细胞均呈上皮样，贴壁生长，生长培基为含有10%（φ）新生牛血清的RPMI1640。
1.2 共培养实验
从裸鼠取前肢骨和后肢骨，去除骨周围的肌肉，沿长轴切开骨干，使骨髓腔暴露，切成0.8 cm长的骨块置于含有抗生素的BGJb培养基中，37 ℃平衡24 h后，将3～5块骨组织加入到生长有58F细胞的T25培养瓶中，与58F细胞进行共培养，培养基为含抗生素和5%胎牛血清的BGJb和RPMI1640（体积比1∶1）混合培养基，连续培养24 h。
1.3 RNA抽提 共培养结束24 h后，弃去骨组织，Dhank’s冲洗58F细胞3次，加入1 mL Trizol 裂解液，冰上5 min，加入200 μL氯仿振荡混匀，4 ℃，12 000 g，离心15 min，吸取上清液至另一灭菌Ep 管内，加入等体积异丙醇，室温沉淀10 min后，4 ℃，12 000 g，离心10 min，弃尽上清，加入1 mL 75 %酒精（φ）洗涤沉淀，4 ℃ 12 000g，5 min，弃尽上清，室温干燥1～3 min，加入20 μL 1‰焦碳酸二乙酯处理水溶解。
1.4 荧光定量RTPCR的检测 反应体积为20 μL，反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，上游引物F（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物R（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL；以βactin为内参。反应条件为：（1）预变性95 ℃ 60 s（2）95 ℃ 5 s，61/55/52/60/57/55 ℃（CXCR4/CTGF/MMP1/IL11/MST1R/ ETV1）15 s，72 ℃ 5 s共45 个循环（3）95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。
1.5 统计学处理
计量数据以±s表示，用SPSS 11.5软件对未处理样本（共培养前58F）与处理样本（共培养后58F）的ΔCt进行两独立样本的t检验（双侧）分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 FQPCR检测58F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的扩增曲线 见图1。（略）
2.2 FQPCR检测58F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的熔解曲线 见图2。（略）
从熔解曲线图中可以看到，βactin熔解温度为89 ℃，不同的基因产物对应不同的熔解温度；在不同样本中，同一基因产物的熔解温度大致相同，证明所扩增的产物特异性较好。
2.3 6种基因在鼻咽癌细胞58F与骨组织共培养前后的表达差异FQPCR中，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，反之，Ct值就越大。在相对定量分析中，将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减，所得出的ΔCt为目的基因相对于内参基因的表达强度，即ΔCt=目的基因Ct内参基因Ct。再使用2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示，-ΔΔCt=-（ΔCt处理样本-ΔCt未处理样本）。2-ΔΔCt>1，目的基因表达上调，反之下调。
3 讨论
骨转移是多种恶性肿瘤晚期的一个共同而又常见的临床表现，可以引起局部剧烈疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等神经症状，严重影响患者的生存质量，通常难以治愈。因此，探索鼻咽癌骨转移的分子机制，对于诊断鼻咽癌骨转移、判断预后以及探索新的治疗策略具有重要意义。
采用SYBR GreenⅠ的FQPCR技术对靶基因进行实时荧光定量分析是近年来发展起来的一项新技术。SYBR GreenⅠ是一种能与双链DNA结合的荧光染料，根据检测出的荧光信号强度可以确定出PCR体系中存在的双链DNA数量，并且通过熔解曲线的分析，排除非特异性扩增的干扰，对靶基因进行定量分析，准确性和灵敏性都比普通RTPCR高。2-ΔΔCt计算方法能够很好地分析靶基因表达的相对差异，该方法无需做标准曲线，比绝对定量方法更加简便可行。
利用肿瘤细胞与骨组织共培养的模型来模拟骨组织微环境对肿瘤细胞的影响。结果显示：58F细胞与骨组织共培养后，肿瘤细胞中CXCR4的表达较共培养前上调3.43倍，CTGF上调1.82倍，MST1R上调23.10倍，ETV1上调2.00倍，这些基因通过化学趋化、促进血管生成、降解细胞外基质等一系列作用，促使鼻咽癌细胞更适合在骨组织中的生长，从而促使骨转移的发生。因此，CXCR4、CTGF、MST1R、ETV1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的标签基因。
参考文献：
[1]李静 实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织骨桥蛋白的表达 临床医学杂志 2012，1（9）：67
[2]王军 实时荧光定量PRC检测鼻咽癌骨转移相关基因的分析 健康之路杂志 2012，2（1）：87