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摘 要：为了解种猪场公猪感染伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）野毒和精液中PRV散毒情况，自2016年10月至2018年3月，我们对河南省22家猪场的219头杜洛克公猪的血清进行了PRV野毒gE抗体检测，同时对这219头公猪相对应的219份杜洛克精液样本进行PRV-gE基因的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测。结果显示：这22家猪场中有2家猪场的公猪PRV野毒gE抗体和精液中PRV-gE基因的PCR检测结果均为阴性；在20家PRV野毒gE抗体检测阳性的猪场中，PRV野毒感染率最低为44.44%，最高为100%；在22家猪场中，公猪PRV野毒平均感染率为79.45%，精液中通过PCR可检测到PRV野毒的平均比例为20.55%；在PRV野毒gE抗体检测结果为阳性的公猪中，25.86%的公猪可通过PCR方法检测证明其精液携带PRV的野毒。结果说明河南省受调查猪场公猪感染PRV比率较高，但PRV野毒gE抗体阳性的公猪通过PCR技术能在精液中检测到阳性的比率较低。
关键词：猪精液；猪PRV；PCR检测
中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2018）09-0020-04
伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的多种动物共患的重要传染病。PRV的主要宿主是猪，PRV感染猪既可通过水平传播，也可通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播。猪感染后：母猪一般表现为返情、不发情或屡配不孕；怀孕猪则出现流产、产死胎和木乃伊胎；公猪常出现睾丸肿胀、萎缩等，种用性能降低或丧失；2周龄以内的仔猪感染后的症状以中枢神经系统障碍为主要特征，也伴有呕吐或腹泻；成年猪多呈隐性感染或出现呼吸系统症状，且长期带毒、排毒。
近年来，随着人工授精技术的普及，规模化养猪业得到迅速发展，随之而来的健康公猪精液带毒传播问题也日益凸显。虽然我国自20世纪70年代中期以来，养猪业广泛使用PRV-gE基因缺失弱毒疫苗进行免疫，这对PRV的防控起到了重要的作用，但携带病原的种猪精液可能被输送到多家猪场，由母猪垂直传播给仔猪，导致疫病的暴发与流行。王金涛在调查中发现某感染猪场在2015年5月全场猪群抽检PRV-gE抗体时还均为阴性，后因6月引种时未对后备种猪进行严格的检疫，从而导致PR在猪场内迅速传播，导致其他猪群被感染。本研究主要应用ELISA和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法对河南22家猪场采集的219头杜洛克种公猪的血清和精液进行PRV-gE野毒抗体和PRV野毒的病原学检测，为了解河南地区部分猪场种公猪PRV野毒感染状况和精液散毒情况提供评估意见和参考数据，为科学预防、控制和净化该疾病提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 精液和血清样本
精液和血清来源于河南省受调查的22家猪场的219头杜洛克生产公猪，这些公猪均免疫过某品牌的进口PRV-gE基因缺失疫苗，每年免疫3～4次，肌注2头份/头。精液样本采集后再进行前腔静脉采血获得血清，统一进行编号。
1.2 主要试剂
IDEXX猪PRV抗体检测试剂盒——HerdChek PRV-gE抗体检测试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自Roche公司，dNTPs、2×ExTaq MasterMix购自北京康为世纪有限公司；DL-2000 DNAMarker购自TaKaRa公司。
1.3 PRV野毒gE抗体的检测方法
具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。
1.4 引物合成及检测方法
引物的合成参照参考文献合成PRV-gE基因的检测引物。采用PCR方法检测，扩增特异性目的片段基因，大小为276 bp。
1.5 精液中PRV DNA提取
用DNA提取试剂盒，分别从每份精液中提取总DNA。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。取200 μL精液，加入200 μL结合缓冲液（Binding Buffer）、40 μL蛋白酶K，立即混匀，70 ℃孵育10 min；加入100 μL异丙醇，混匀；将处理样本加到过滤管，8 000 r/min离心1 min；离心弃液体，加入500 μL除抑制剂缓冲液（Inhibitor Removal Buffer），8 000 r/min离心1 min；弃液体，加入500 μL清洗缓冲液（Wash Buffer），8 000 r/min离心1 min； 12 000 r/min空离心10 s；加入200 μL 70 ℃预热的洗脱缓冲液（Elution Buffer），放置3 min～5 min，8 000 r/min 离心1 min，于-70 ℃冻存。
1.6 目的基因片段的扩增
PCR反应体系以及反应参数参照参考文献中的说明设置。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶0.5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物（20 μmol/μL） 各0.5 μL、4 μL DNA，加水至50 μL。PCR反应参数为：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個循环；72 ℃，10 min。反应结束后取5 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察。
2 结果与分析
2.1 猪PRV野毒gE抗体检测情况
抗体检测实验成立条件为：阴性对照OD650平均值-阳性对照OD650平均值≥0.30。S/N=待检样本OD650/阴性对照OD450均值，检测结果判定：S/N值≤0.60，判断为样本抗体阳性；S/N值>0.70，判断为样本抗体阴性；0.60 2.2 精液中PRV PCR检测结果
在凝胶成像系统中，PRV的特异性引物可以从部分样本中扩增出大小约276 bp的特异性条带，说明检测的某些样本中含有PRV（图1）。
2.3 不同猪场公猪精液中PRV野毒的检测结果
对来自河南22家猪场采集的219份种公猪精液样本进行了PCR检测。根据PCR检测结果，发现16家猪场的公猪精液存在不同程度的带毒情況，占检测猪场总数的72.73%（表2）。在219份精液中，通过PCR技术检测出的伪狂犬阳性率为20.55%。血清PRV野毒gE抗体阴性的公猪个体，其精液通过PCR检测未检出PRV野毒。血清PRV野毒gE抗体阳性的公猪群体，其精液通过PCR检测出PRV野毒的比率为25.86%。
3 讨论
猪的繁殖障碍性疾病主要包括由病毒、细菌、寄生虫和一些霉形体引发的疾病，其中病毒性疫病危害最大，一旦发生和流行，就会给养猪业带来严重的经济损失。在猪场常发生的各类病毒性疾病中，古典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、PRV、猪细小病毒是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原，而这些病毒的显著特征是均可通过交配或精液输入而引起垂直传播。随着人工授精技术的普及，这些病原通过精液垂直传播的概率也大大增加。孙泉云等报告过某猪场用2头PRV阳性的公猪配种引发猪PR疫情，最终导致近百万元的损失。党占国等报告2012年1月—2015年8月PR流行情况呈逐年递增趋势，说明近年来在规模猪场疫病防控中PR呈高发态势。
本试验通过ELISA和PCR分别对公猪血清和精液进行了PRV野毒gE抗体检测和PRV-gE基因的PCR检测，结果显示虽然受检公猪血清PRV野毒gE抗体阳性率很高（平均阳性率为79.45%），但公猪精液能检测出PRV野毒阳性的比例却较低，只有20.55%。且血清PRV野毒抗体为阴性的公猪其精液中也检测不到PRV野毒。由于受检公猪均为生产公猪，可排除母源抗体的影响，所以血清中PRV-gE抗体的存在证明该公猪已经感染了PRV野毒。但血清PRV野毒抗体为阳性的公猪，其精液中检测到PRV野毒的比率只有25.86%，这说明已经感染PRV野毒的公猪大多数不会通过精液排毒，或者说明感染PRV野毒的公猪，其精液存在阶段性排毒现象。我们应高度重视这些存在PRV的精液，它们将在伪狂犬病的垂直传播中起到重要作用。带毒精液可将病毒传染给母猪或直接垂直传播感染胎儿。
因此，研究感染PRV野毒的公猪精液排毒规律和消灭公猪精液中PRV，将是在无法彻底净化公猪中PR时防治PR通过公猪进行扩散的可行措施，也可为PR的彻底净化提供理论依据。猪场特别是种猪场应进行这方面的监测工作，建立一套详细的疫病监测和净化措施，将可有效避免PR通过精液传播和扩散。
关键词：猪精液；猪PRV；PCR检测
中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2018）09-0020-04
伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的多种动物共患的重要传染病。PRV的主要宿主是猪，PRV感染猪既可通过水平传播，也可通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播。猪感染后：母猪一般表现为返情、不发情或屡配不孕；怀孕猪则出现流产、产死胎和木乃伊胎；公猪常出现睾丸肿胀、萎缩等，种用性能降低或丧失；2周龄以内的仔猪感染后的症状以中枢神经系统障碍为主要特征，也伴有呕吐或腹泻；成年猪多呈隐性感染或出现呼吸系统症状，且长期带毒、排毒。
近年来，随着人工授精技术的普及，规模化养猪业得到迅速发展，随之而来的健康公猪精液带毒传播问题也日益凸显。虽然我国自20世纪70年代中期以来，养猪业广泛使用PRV-gE基因缺失弱毒疫苗进行免疫，这对PRV的防控起到了重要的作用，但携带病原的种猪精液可能被输送到多家猪场，由母猪垂直传播给仔猪，导致疫病的暴发与流行。王金涛在调查中发现某感染猪场在2015年5月全场猪群抽检PRV-gE抗体时还均为阴性，后因6月引种时未对后备种猪进行严格的检疫，从而导致PR在猪场内迅速传播，导致其他猪群被感染。本研究主要应用ELISA和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法对河南22家猪场采集的219头杜洛克种公猪的血清和精液进行PRV-gE野毒抗体和PRV野毒的病原学检测，为了解河南地区部分猪场种公猪PRV野毒感染状况和精液散毒情况提供评估意见和参考数据，为科学预防、控制和净化该疾病提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 精液和血清样本
精液和血清来源于河南省受调查的22家猪场的219头杜洛克生产公猪，这些公猪均免疫过某品牌的进口PRV-gE基因缺失疫苗，每年免疫3～4次，肌注2头份/头。精液样本采集后再进行前腔静脉采血获得血清，统一进行编号。
1.2 主要试剂
IDEXX猪PRV抗体检测试剂盒——HerdChek PRV-gE抗体检测试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自Roche公司，dNTPs、2×ExTaq MasterMix购自北京康为世纪有限公司；DL-2000 DNAMarker购自TaKaRa公司。
1.3 PRV野毒gE抗体的检测方法
具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。
1.4 引物合成及检测方法
引物的合成参照参考文献合成PRV-gE基因的检测引物。采用PCR方法检测，扩增特异性目的片段基因，大小为276 bp。
1.5 精液中PRV DNA提取
用DNA提取试剂盒，分别从每份精液中提取总DNA。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。取200 μL精液，加入200 μL结合缓冲液（Binding Buffer）、40 μL蛋白酶K，立即混匀，70 ℃孵育10 min；加入100 μL异丙醇，混匀；将处理样本加到过滤管，8 000 r/min离心1 min；离心弃液体，加入500 μL除抑制剂缓冲液（Inhibitor Removal Buffer），8 000 r/min离心1 min；弃液体，加入500 μL清洗缓冲液（Wash Buffer），8 000 r/min离心1 min； 12 000 r/min空离心10 s；加入200 μL 70 ℃预热的洗脱缓冲液（Elution Buffer），放置3 min～5 min，8 000 r/min 离心1 min，于-70 ℃冻存。
1.6 目的基因片段的扩增
PCR反应体系以及反应参数参照参考文献中的说明设置。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶0.5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物（20 μmol/μL） 各0.5 μL、4 μL DNA，加水至50 μL。PCR反应参数为：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個循环；72 ℃，10 min。反应结束后取5 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察。
2 结果与分析
2.1 猪PRV野毒gE抗体检测情况
抗体检测实验成立条件为：阴性对照OD650平均值-阳性对照OD650平均值≥0.30。S/N=待检样本OD650/阴性对照OD450均值，检测结果判定：S/N值≤0.60，判断为样本抗体阳性；S/N值>0.70，判断为样本抗体阴性；0.60
在凝胶成像系统中，PRV的特异性引物可以从部分样本中扩增出大小约276 bp的特异性条带，说明检测的某些样本中含有PRV（图1）。
2.3 不同猪场公猪精液中PRV野毒的检测结果
对来自河南22家猪场采集的219份种公猪精液样本进行了PCR检测。根据PCR检测结果，发现16家猪场的公猪精液存在不同程度的带毒情況，占检测猪场总数的72.73%（表2）。在219份精液中，通过PCR技术检测出的伪狂犬阳性率为20.55%。血清PRV野毒gE抗体阴性的公猪个体，其精液通过PCR检测未检出PRV野毒。血清PRV野毒gE抗体阳性的公猪群体，其精液通过PCR检测出PRV野毒的比率为25.86%。
3 讨论
猪的繁殖障碍性疾病主要包括由病毒、细菌、寄生虫和一些霉形体引发的疾病，其中病毒性疫病危害最大，一旦发生和流行，就会给养猪业带来严重的经济损失。在猪场常发生的各类病毒性疾病中，古典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、PRV、猪细小病毒是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原，而这些病毒的显著特征是均可通过交配或精液输入而引起垂直传播。随着人工授精技术的普及，这些病原通过精液垂直传播的概率也大大增加。孙泉云等报告过某猪场用2头PRV阳性的公猪配种引发猪PR疫情，最终导致近百万元的损失。党占国等报告2012年1月—2015年8月PR流行情况呈逐年递增趋势，说明近年来在规模猪场疫病防控中PR呈高发态势。
本试验通过ELISA和PCR分别对公猪血清和精液进行了PRV野毒gE抗体检测和PRV-gE基因的PCR检测，结果显示虽然受检公猪血清PRV野毒gE抗体阳性率很高（平均阳性率为79.45%），但公猪精液能检测出PRV野毒阳性的比例却较低，只有20.55%。且血清PRV野毒抗体为阴性的公猪其精液中也检测不到PRV野毒。由于受检公猪均为生产公猪，可排除母源抗体的影响，所以血清中PRV-gE抗体的存在证明该公猪已经感染了PRV野毒。但血清PRV野毒抗体为阳性的公猪，其精液中检测到PRV野毒的比率只有25.86%，这说明已经感染PRV野毒的公猪大多数不会通过精液排毒，或者说明感染PRV野毒的公猪，其精液存在阶段性排毒现象。我们应高度重视这些存在PRV的精液，它们将在伪狂犬病的垂直传播中起到重要作用。带毒精液可将病毒传染给母猪或直接垂直传播感染胎儿。
因此，研究感染PRV野毒的公猪精液排毒规律和消灭公猪精液中PRV，将是在无法彻底净化公猪中PR时防治PR通过公猪进行扩散的可行措施，也可为PR的彻底净化提供理论依据。猪场特别是种猪场应进行这方面的监测工作，建立一套详细的疫病监测和净化措施，将可有效避免PR通过精液传播和扩散。