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论文摘要：文章分析了鹿角脱盘蛋白提取工艺
主题词： 鹿角托盘 蛋白 提取
鹿角脱盘（Sika antler base）作为鹿产品的一种，是雄性梅花鹿Cervw nippon Temminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物，具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等。
目前，对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入，在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。本文报道为鹿角脱盘蛋白的提取工艺部分。
一仪器与材料
梅花鹿鹿角脱盘，购自吉林省东风药业有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、 十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司；过硫酸铵（Ammonium Persulfate）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）、考马斯亮蓝 R250（Coomassie Blue R250）、溴酚蓝购自Amresaco公司；低分子量标准蛋白质（包括6种标准蛋白，相对分子质量分别为97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa），购于中国科学院上海生物化学研究所；其它试剂均为分析纯。
TDL-5型台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；CP225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂）；LL3000 型冷冻干燥机（德国Heto公司）；高速离心机（Eppendorf公司）；电泳仪、垂直板电泳槽（北京六一仪器厂）。
二、方法与结果
1 、不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份，每份300 mg。分别加入pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的缓冲溶液，按料液比1∶10浸提，时间为3h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，当pH值为12时，提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。
2、 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比（W/V）分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。料液比为1∶5和1∶10时提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多，但差别并不明显，因此在浸提过程中选择料液比为1∶5。
3 、不同浸提时间对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉5份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比1∶5，时间依次为3，6，8，12，24 h，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。。从左至右样品顺序依次为：Marker、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa
4、 不同浸提盐浓度对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉10份，每份300 mg。其中5份依次加入含EDTA 10，20，30，40，50 mmol/L的pH12的缓冲溶液浸提，另5份依次加入含NaCl 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的pH12的缓冲溶液浸提，料液比为1∶5，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，經SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，随着EDTA浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到50 mmol/L时提取效果最好，因此确定浸提时EDTA的浓度为50 mmol/L；随着NaCl浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到0.5 mol/L时提取效果最好，因此确定浸提时NaCl的浓度为0.5 mol/L。
综上所述，鹿角脱盘蛋白的提取工艺确定为：pH值12的缓冲液（含50 mmol/L EDTA、0.5 M NaCl）浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。
5 、验证试验称取鹿角脱盘粉3份，每份5 g，按上述工艺进行提取，经80%硫酸铵沉淀，透析后冻干，采用Bradford法测定蛋白含量，收率及纯度。
三、 讨论
近年来，随着人们生活水平的提高和大众健康、保健意识的增强，对鹿角盘的化学成分、功能评价、药理作用等进行了一定的研究。由于鹿角脱盘是鹿茸骨化后的产物，含有大量钙磷等化合物，构成了坚硬的结构，使得包含其中的蛋白等有效成分难以分离提取，直接影响了人们对它的研究。本实验考察了不同pH值、不同盐浓度、不同料液比等影响因素对鹿角脱盘蛋白提取效果的影响，确定了鹿角脱盘蛋白的提取工艺。由实验结果可以看出，当浸提缓冲溶液的pH为碱性时，鹿角脱盘蛋白的提取效果最高，由此证明鹿角脱盘中含有大量的酸性蛋白，因此在碱性条件下更易溶出。随着EDTA浓度的增加，蛋白的提取效果也随之增加，主要原因是由于鹿角脱盘为骨化组织，含有大量的钙离子，与蛋白质结合从而限制其溶解，加入EDTA可以络合钙离子，从而使蛋白释放溶解。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，实验结果表明鹿角脱盘蛋白需在较高的盐浓度下才可溶解。
参考文献：
[1] 幺宝金，赵雨，牛放，黄萍，杨菲，李娟，鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究[J]. 论文网，2011 ：04.
[2] 陈玉山，王振玉，王本祥. 鹿角脱盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].生化药物杂志，1987，2：12.
主题词： 鹿角托盘 蛋白 提取
鹿角脱盘（Sika antler base）作为鹿产品的一种，是雄性梅花鹿Cervw nippon Temminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物，具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等。
目前，对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入，在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。本文报道为鹿角脱盘蛋白的提取工艺部分。
一仪器与材料
梅花鹿鹿角脱盘，购自吉林省东风药业有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、 十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司；过硫酸铵（Ammonium Persulfate）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）、考马斯亮蓝 R250（Coomassie Blue R250）、溴酚蓝购自Amresaco公司；低分子量标准蛋白质（包括6种标准蛋白，相对分子质量分别为97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa），购于中国科学院上海生物化学研究所；其它试剂均为分析纯。
TDL-5型台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；CP225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂）；LL3000 型冷冻干燥机（德国Heto公司）；高速离心机（Eppendorf公司）；电泳仪、垂直板电泳槽（北京六一仪器厂）。
二、方法与结果
1 、不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份，每份300 mg。分别加入pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的缓冲溶液，按料液比1∶10浸提，时间为3h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，当pH值为12时，提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。
2、 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比（W/V）分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。料液比为1∶5和1∶10时提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多，但差别并不明显，因此在浸提过程中选择料液比为1∶5。
3 、不同浸提时间对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉5份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比1∶5，时间依次为3，6，8，12，24 h，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。。从左至右样品顺序依次为：Marker、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa
4、 不同浸提盐浓度对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉10份，每份300 mg。其中5份依次加入含EDTA 10，20，30，40，50 mmol/L的pH12的缓冲溶液浸提，另5份依次加入含NaCl 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的pH12的缓冲溶液浸提，料液比为1∶5，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，經SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，随着EDTA浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到50 mmol/L时提取效果最好，因此确定浸提时EDTA的浓度为50 mmol/L；随着NaCl浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到0.5 mol/L时提取效果最好，因此确定浸提时NaCl的浓度为0.5 mol/L。
综上所述，鹿角脱盘蛋白的提取工艺确定为：pH值12的缓冲液（含50 mmol/L EDTA、0.5 M NaCl）浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。
5 、验证试验称取鹿角脱盘粉3份，每份5 g，按上述工艺进行提取，经80%硫酸铵沉淀，透析后冻干，采用Bradford法测定蛋白含量，收率及纯度。
三、 讨论
近年来，随着人们生活水平的提高和大众健康、保健意识的增强，对鹿角盘的化学成分、功能评价、药理作用等进行了一定的研究。由于鹿角脱盘是鹿茸骨化后的产物，含有大量钙磷等化合物，构成了坚硬的结构，使得包含其中的蛋白等有效成分难以分离提取，直接影响了人们对它的研究。本实验考察了不同pH值、不同盐浓度、不同料液比等影响因素对鹿角脱盘蛋白提取效果的影响，确定了鹿角脱盘蛋白的提取工艺。由实验结果可以看出，当浸提缓冲溶液的pH为碱性时，鹿角脱盘蛋白的提取效果最高，由此证明鹿角脱盘中含有大量的酸性蛋白，因此在碱性条件下更易溶出。随着EDTA浓度的增加，蛋白的提取效果也随之增加，主要原因是由于鹿角脱盘为骨化组织，含有大量的钙离子，与蛋白质结合从而限制其溶解，加入EDTA可以络合钙离子，从而使蛋白释放溶解。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，实验结果表明鹿角脱盘蛋白需在较高的盐浓度下才可溶解。
参考文献：
[1] 幺宝金，赵雨，牛放，黄萍，杨菲，李娟，鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究[J]. 论文网，2011 ：04.
[2] 陈玉山，王振玉，王本祥. 鹿角脱盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].生化药物杂志，1987，2：12.