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摘 要: 目的：通过多聚酶链反应(PCR)检测胃病患者口腔中的幽门螺杆菌(HP)。方法：从13例有上消化道症状、经内镜检查证实的胃病患者采集胃黏膜、口腔含漱液和6个牙位的龈上及龈下菌斑，应用(PCR)检测标本中的HP。同时用酶联免疫法检测静脉血、唾液、龈沟液中抗HP特异性IgG抗体。结果PCR检测胃黏膜均为HP阳性。6例患者(46.2％)的含漱液和11例患者(84.6％)的至少一份菌斑样本中检测出HP。口腔黏膜与胃黏膜HP阳性率高于一般人，此外从患者静脉血、唾液、龈沟液中均可检测到HP特异性IgG抗体。结论：本研究结果表明龈沟或牙周袋可能是口腔HP聚集的适宜环境。
关键词: 幽门螺杆菌 牙菌斑 龈沟液 特异抗体
资料方法
一般资料：13例主诉有上消化道症状而进行内镜检查的患者，男8例，女5例，平均42岁(34~52岁)，无其他重要系统性疾病，3个月内未服抗生素及胃病，均有牙龈炎或轻度牙周炎，过去12个月内未接受牙周治疗，全口牙不少于24颗。
取样和检查：①口腔取样：所有受检者检测晨均按指导刷牙，取样前用无菌生理盐水轻轻将口腔漱干净，上午收集无刺激唾液1份，从每个患者口腔中的6个区段各选择有牙龈炎症的1颗牙作为取样牙，隔湿吹干后，用消毒刮匙取龈上菌斑留存。用what man 3 mm滤纸条收集(袋内法)30秒龈沟液。刮取龈下菌斑。口腔含0.9％生理盐水10ml鼓漱1 5秒后留存于离心管。取样后检查并记录牙周临床指数、菌斑指数、探诊深度(PD)、出血指数(BI)。 ②胃内取样：口腔取样后立既进行常规胃镜检查，在胃窦部共取4块组织，1块做HP尿素酶试验；2块用10%福尔马林固定，石蜡切片，用Worthin-Starry银染色辨认HP，并做出组织病理学诊断；另一块用于PCR扩增检测HP。
口腔及胃内取样后抽取前臂静脉血2ml，提取血液与唾液、龈沟液等标本置-70℃保存。
PCR检测HP：①DNA提取：口腔含漱液经离心(12000转/分，5分钟)后弃上清，沉淀物及菌斑样本均在2小时内按PCR试剂盒说明书用快提法提取DNA。胃组织DNA提取流程如下：置0.5ml Tris-EDTA缓冲液(PH8.0)研磨匀浆，加10％十二烷基硫酸钠(SDS)至浓度为1％，蛋白酶K(20mg／ml)至终浓度为100mg/ml，5.5℃水浴1小时，用等体积酶-氯仿-异戊醇(25：24：1)抽取2次，纯酒精沉淀，1200转/分(4℃)离心10分钟，沉淀用超净水溶解，-20℃备用。②PCR检测：PCR试剂盒内含2对引物，分别根据HP尿素酶C基因和细胞毒素相关基因设计，目的片段为294bp和400bp。PCR扩增采用20μl反应体系，2对引物各20pm，口腔标本4μl(胃黏膜标本2μl)作为DNA模板。反应混合液在94℃预变性5分钟，并以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为一循环，共计35个循环，最后一个循环72℃继续延伸7分钟。采用HP标准株NCTC11637和1株HP临床分离株DNA分别作为阳性模板，PCR试剂盒提供阴性对照。扩增产物以8%丙稀酰胺电脉签定。为避免交叉传染，分别在3个房间进行DNA提取PCR扩增和产物的电泳分析。③ELISA检测抗HP IgG抗体，用金菌抗原(由中国人胃中分离的HP临床株制作)包被酶标板。血清标本PBSTTGG(0.01mg/ml硫柳汞，0.05%吐温-20，1.0mg/ml明胶，50mg/mlγ-球蛋白)1：800稀释，龈沟液以50μl IPBSTTGG 2次离心洗提(1000转/分，4℃)，上清用于抗体检测。取稀释后的血清、洗提后的龈沟液、未经稀释的唾液个100μl分别加入孔。已知HP抗体阳性的血清和阴性血清作为对照。在酶标读数仪(BIO-PCR450)415nrm波长下读数，判断值≥1.0为阳性。
结 果
胃黏膜标本检测结果：13例胃黏膜标本中有12例银染法与PCR法均为HP阳性，另1例银染法阴性，而PCR阳性。
口腔中的HP检测：PCR结果显示13例患者中有6例(46.2%)从含漱液中检出HP，11例(84.6%)患者至少有1份菌斑样本中检出HP。龈下菌斑中HP的检出率(30/78，38.5%)显著高于龈上菌斑(15/28，19.2%)(P<0.01)。龈上和龈下菌斑共156份合并计算，其中尿素酶C基因阳性率为28.8%(45/156)，尿素酶C基因和cag A基因共同阳性为3.2%(5/156)，这些双阳性的标本来自2例患者的3颗牙齿(龈上3份，龈下2份)。
抗HP特异抗体检测：从血清、唾液、龈沟液中均可检测到抗HP IgG抗体。检出率依次为血清、唾液、龈沟液。
讨 论
与其他常规方法相比，PCR技术显著提高了口腔HP的检出率，我们选择美国市售PCR试剂盒，2对引物根据尿素酶C基因和cagA基因设计，Bickiey、Lage等通过杂交和酶切证实了其特异性，其敏感性可达到检出100个细菌。本研究结果也证明PCR比常规的Warthin-Starry银染法敏感。针对以往口腔HP研究，无论采用常规方法还是PCR，结果往往不一致。Mapstone、Nguyen等从有限的病例中采集多份口腔标本(菌斑、唾液)，阳性率分别达到38.5%和27.8%，显示口腔的HP的检出率存在不规律性。而国内报道用PCR检测胃炎患者唾液中HP，检出率较低(5.71％，6/105)。我们分析，以往研究存在差异的重要原因之一在于菌斑或唾液中HP的数量较少，而且在口腔内的分布规律不清楚，加之许多研究仅取一份菌斑或唾液，导致假阴性率较高；而口腔HP分布规律的研究也尚未得到重视。本研究从每位患者口腔中取多份样本检测，可提高检出率。从研究结果看，龈下菌斑HP检出率(38.5%)显著高于龈上菌斑(19.2%)，其中2例患者龈下菌斑中检出HP，而其他所有龈上菌斑及含漱液均未检出，提示龈沟或牙周袋可能是口腔HP聚集的适宜环境。进一步研究应扩大样本量，以期更为准确地反映口腔内HP的存在情况和分布特点。
关键词: 幽门螺杆菌 牙菌斑 龈沟液 特异抗体
资料方法
一般资料：13例主诉有上消化道症状而进行内镜检查的患者，男8例，女5例，平均42岁(34~52岁)，无其他重要系统性疾病，3个月内未服抗生素及胃病，均有牙龈炎或轻度牙周炎，过去12个月内未接受牙周治疗，全口牙不少于24颗。
取样和检查：①口腔取样：所有受检者检测晨均按指导刷牙，取样前用无菌生理盐水轻轻将口腔漱干净，上午收集无刺激唾液1份，从每个患者口腔中的6个区段各选择有牙龈炎症的1颗牙作为取样牙，隔湿吹干后，用消毒刮匙取龈上菌斑留存。用what man 3 mm滤纸条收集(袋内法)30秒龈沟液。刮取龈下菌斑。口腔含0.9％生理盐水10ml鼓漱1 5秒后留存于离心管。取样后检查并记录牙周临床指数、菌斑指数、探诊深度(PD)、出血指数(BI)。 ②胃内取样：口腔取样后立既进行常规胃镜检查，在胃窦部共取4块组织，1块做HP尿素酶试验；2块用10%福尔马林固定，石蜡切片，用Worthin-Starry银染色辨认HP，并做出组织病理学诊断；另一块用于PCR扩增检测HP。
口腔及胃内取样后抽取前臂静脉血2ml，提取血液与唾液、龈沟液等标本置-70℃保存。
PCR检测HP：①DNA提取：口腔含漱液经离心(12000转/分，5分钟)后弃上清，沉淀物及菌斑样本均在2小时内按PCR试剂盒说明书用快提法提取DNA。胃组织DNA提取流程如下：置0.5ml Tris-EDTA缓冲液(PH8.0)研磨匀浆，加10％十二烷基硫酸钠(SDS)至浓度为1％，蛋白酶K(20mg／ml)至终浓度为100mg/ml，5.5℃水浴1小时，用等体积酶-氯仿-异戊醇(25：24：1)抽取2次，纯酒精沉淀，1200转/分(4℃)离心10分钟，沉淀用超净水溶解，-20℃备用。②PCR检测：PCR试剂盒内含2对引物，分别根据HP尿素酶C基因和细胞毒素相关基因设计，目的片段为294bp和400bp。PCR扩增采用20μl反应体系，2对引物各20pm，口腔标本4μl(胃黏膜标本2μl)作为DNA模板。反应混合液在94℃预变性5分钟，并以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为一循环，共计35个循环，最后一个循环72℃继续延伸7分钟。采用HP标准株NCTC11637和1株HP临床分离株DNA分别作为阳性模板，PCR试剂盒提供阴性对照。扩增产物以8%丙稀酰胺电脉签定。为避免交叉传染，分别在3个房间进行DNA提取PCR扩增和产物的电泳分析。③ELISA检测抗HP IgG抗体，用金菌抗原(由中国人胃中分离的HP临床株制作)包被酶标板。血清标本PBSTTGG(0.01mg/ml硫柳汞，0.05%吐温-20，1.0mg/ml明胶，50mg/mlγ-球蛋白)1：800稀释，龈沟液以50μl IPBSTTGG 2次离心洗提(1000转/分，4℃)，上清用于抗体检测。取稀释后的血清、洗提后的龈沟液、未经稀释的唾液个100μl分别加入孔。已知HP抗体阳性的血清和阴性血清作为对照。在酶标读数仪(BIO-PCR450)415nrm波长下读数，判断值≥1.0为阳性。
结 果
胃黏膜标本检测结果：13例胃黏膜标本中有12例银染法与PCR法均为HP阳性，另1例银染法阴性，而PCR阳性。
口腔中的HP检测：PCR结果显示13例患者中有6例(46.2%)从含漱液中检出HP，11例(84.6%)患者至少有1份菌斑样本中检出HP。龈下菌斑中HP的检出率(30/78，38.5%)显著高于龈上菌斑(15/28，19.2%)(P<0.01)。龈上和龈下菌斑共156份合并计算，其中尿素酶C基因阳性率为28.8%(45/156)，尿素酶C基因和cag A基因共同阳性为3.2%(5/156)，这些双阳性的标本来自2例患者的3颗牙齿(龈上3份，龈下2份)。
抗HP特异抗体检测：从血清、唾液、龈沟液中均可检测到抗HP IgG抗体。检出率依次为血清、唾液、龈沟液。
讨 论
与其他常规方法相比，PCR技术显著提高了口腔HP的检出率，我们选择美国市售PCR试剂盒，2对引物根据尿素酶C基因和cagA基因设计，Bickiey、Lage等通过杂交和酶切证实了其特异性，其敏感性可达到检出100个细菌。本研究结果也证明PCR比常规的Warthin-Starry银染法敏感。针对以往口腔HP研究，无论采用常规方法还是PCR，结果往往不一致。Mapstone、Nguyen等从有限的病例中采集多份口腔标本(菌斑、唾液)，阳性率分别达到38.5%和27.8%，显示口腔的HP的检出率存在不规律性。而国内报道用PCR检测胃炎患者唾液中HP，检出率较低(5.71％，6/105)。我们分析，以往研究存在差异的重要原因之一在于菌斑或唾液中HP的数量较少，而且在口腔内的分布规律不清楚，加之许多研究仅取一份菌斑或唾液，导致假阴性率较高；而口腔HP分布规律的研究也尚未得到重视。本研究从每位患者口腔中取多份样本检测，可提高检出率。从研究结果看，龈下菌斑HP检出率(38.5%)显著高于龈上菌斑(19.2%)，其中2例患者龈下菌斑中检出HP，而其他所有龈上菌斑及含漱液均未检出，提示龈沟或牙周袋可能是口腔HP聚集的适宜环境。进一步研究应扩大样本量，以期更为准确地反映口腔内HP的存在情况和分布特点。