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[摘要] 目的 分析梅毒螺旋体抗体酶联免疫吸附试验(TPELISA)双抗原夹心一步法检测梅毒螺旋体抗体中出现的钩状效应,探讨其对检测结果的影响以及避免措施。 方法 TPELISA双抗原夹心一步法检测结果为阴性的10份可疑标本,分别用双抗夹心二步法、稀释法和梅毒特异性抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)进行梅毒螺旋体特异性抗体检测。结果 10份用TPELISA双抗原夹心一步法检测结果为阴性的可疑标本,用双抗原夹心二步法检测时结果全部转为阳性;TPPA检测结果为阳性而且效价均大于1∶1280;标本经倍比稀释后,分别采用TPELISA双抗原夹心一步法和二步法进行测定,用一步法在1∶2和1∶4时分别有4例和2例测定结果仍为阴性,稀释度在1∶512范围内检测结果均为阳性; TPELISA一步法测定结果的吸光度随着血清稀释倍数的增加,吸光度值逐渐增加达高峰,后吸光度逐渐减小,曲线呈“钟形”;二步法则曲线在开始的时候维持在高值并无太大变化,而后随稀释倍数增加吸光度值逐渐下降,曲线呈倒“S形”。结论 TPELISA一步法在检测梅毒螺旋体特异性抗体中存在“钩状效应”,用稀释法或者两步法可以避免该效应。
[关键词] 梅毒螺旋体;钩状效应;酶联免疫吸附试验
文章编号:1003-1383(2009)04-0421-03
中图分类号:R 446.61
文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.023
梅毒是由梅毒螺旋体(TP)感染引起的疾病,以性传播为主,也可以通过血液及母婴等形式传播。因此,对献血员、产妇、输血患者进行梅毒螺旋体感染的实验室检查具有非常重要的意义。我们选取10份临床可疑标本进行检测,就TP
ELISA中的“钩状效应”产生的原因和避免措施进行探讨。
材料和方法
1.血清标本来源本院住院和门诊病人中临床症状和病史疑似梅毒,血清TPELISA一步法检测阴性,TPPA试验检测阳性的标本10例。
2.试剂和仪器 TPELISA梅毒螺旋体抗体检测试剂盒为上海科华生物工程公司生产,TPPA试剂盒由日本富士瑞必欧株式会社提供。酶标仪和洗板机为雷杜公司的RT6000型和RT3000型。
3.方法 用TPELISA双抗原夹心一步法和二步法分别对样本的原液及稀释液进行检测。一步法按试剂盒说明书操作;二步法用一步法试剂先加血清样本,37℃孵育30分钟,洗板,再加酶标抗体。TPPA检测步骤按试剂说明书进行。
结果
1.用双抗原夹心一步法检测梅毒螺旋体特异性抗体阴性的10份可疑标本,用二步法检测,结果转为阳性;用TPPA检测也均为阳性,而且其效价均大于1∶1280,见表1。
表1 不同检测方法对样本的检测结果
标本号TPELISA一步法OD值结果
TPELISA两步法OD值结果TPPA
10.056- 0.122+1∶1280
20.034- 0.290+ 1∶1280
30.028- 0.322+1∶2560
40.043- 0.117+1∶2560
50.021- 0.671+1∶1280
60.045- 0.338+1∶5120
70.026- 1.147+1∶1280
80.024- 0.416+1∶1280
90.063- 0.134+1∶2560
100.064- 0.734+1∶2560
注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:阳性;“-”:阴性
2.分别用双抗原夹心一步法和二步法测定10份经过1∶2,1∶4…… 1∶2048倍比稀释的标本,10份标本各稀释度的吸光度(A)的均值见表2。两种方法测定的吸光度值与血清抗体浓度的关系见图1。用双抗原夹心一步法测定不同稀释度血清,吸光度值随着稀释倍数的增加逐渐升高,达到较高水平后又逐渐下降,曲线变化呈“钟形”;二步法则吸光度值开始维持在高值并无太大变化,而后随稀释度增加而逐渐下降,曲线呈倒“S”形。
3.TPELISA一步法和二步法对不同稀释度血清的抗体检出情况比较 一步法的漏检率呈两极现象。见表3。
表2 TPELISA一步法和二步法检测不同稀释度血清的吸光度均值
稀释度TPELISA一步法OD值结果
TPELISA二步法OD值结果
1∶20.012- 1.866+
1∶40.290+ 1.810+
1∶80.690+ 1.712+
1∶161.396+ 1.654+
1∶321.805+ 1.702+
1∶641.528+ 1.523+
1∶1281.151+ 0.789+
1∶2560.984+ 0.671+
1∶5120.416+ 0.447+
1∶10240.134+ 0.134+
1∶20480.077- 0.124+
注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:阳性;“-”:阴性
图1 TPELISA双抗原一步法和二步法检测不同稀释度血清的吸光度值变化曲线
表3 一步法和二步法对不同稀释度标本的检出情况
稀释倍数一步法阳性(N)阴性(N)
二步法阳性(N)阴性(N)一步法漏检率(%)
1∶1010 100100
1∶264 10040
1∶482 10020
1∶8100 1000
1∶16100 1000
1∶32100 1000
1∶64100 1000
1∶128100 1000
1∶256100 1000
1∶512100 1000
1∶102473 9130
1∶204864 8244
讨论
目前,针对梅毒的血清学检查主要包括TP特异性和非特异性抗体检测。梅毒非特异性抗体检测包括快速血清反应素环状卡片试验(RPR)和(TRUST)等;而对特异性抗体检测方法有:梅毒螺旋体血球凝集实验(TPHA),TPPA,免疫印迹实验(Western blot),荧光密螺旋体抗体吸附实验(FTAABS)及TPELISA等。TPPA,TPHA,免疫印迹,FTAABS虽然特异性很强,但因为成本较高,操作步骤烦琐而不适合对于大批量标本的检测。而ELISA法具有操作简单、用时短、灵敏度高和成本低廉等优点而普遍被各医疗机构卫生防疫部门以及血液中心采用,作为大批量标本梅毒抗体的筛查方法。TPELISA是利用基因工程合成的梅毒抗原,通过双抗原夹心法检测梅毒特异性抗体[1],主要包括TPELISA双抗原夹心一步法和二步法。TPELISA一步法因其具有操作简单、反应快速、敏感性高、结果易于判断及易于进行质量控制等优点被广泛采用,逐渐取代了RPR,成为医疗卫生机构和血站的梅毒筛选方法。但是,由于TPELISA一步法检测技术中“钩状效应”的存在,可以引起检测结果假阴性。因此,如何避免“钩状效应”,减少阳性病例的漏诊率成为目前研究的重点。
TPELISA法检测梅毒特异性抗体的方法主要包括:双抗原夹心法和间接法。双抗原夹心法主要检测梅毒特异性抗体IgG和IgM总抗体。双抗原夹心一步法测定梅毒特异性抗体是最常用的方法。其原理是在同一个ELISA检测体系中同时加入待测标本(含抗体)和酶标记抗原,形成的结合物包括:固相抗原+待测抗体(A), 固相抗原+待测抗体+酶标抗原(B),待测抗体+酶标抗原(C),酶标抗原+待测抗体+酶标抗原(D),在这4种结合物中,只有(B)结合物才是要测定的目的结合物。如果在反应体系中,待测的抗体浓度太高,由于竞争抑制作用,(C)和(D)类结合物增多,(B)类结合物减少,导致反应显色降低,甚至不显色,这就是所谓的“钩状效应”[2]。
在本研究中,通过采用TPELISA双抗原夹心一步法、二步法及TPPA检测10份可疑标本,结果表明,用双抗原夹心一步法检测为阴性的这10份标本,用二步法检测均转为阳性,TPPA检测结果也均为阳性,而且滴度均达到1∶1280以上;将10份标本再进行倍比稀释并同时用双抗原夹心一步法和二步法同时进行检测,稀释度在1∶2和1∶4时,一步法检分别有4例和2例检测结果仍为阴性,其余稀释度血清用双抗原夹心一步法和二步法检测,结果均为阳性,这说明了双抗原夹心一步法对高浓度抗体标本的检测是存在钩状效应的,而将存在钩状效应的标本经过稀释后可以消除,但是稀释的倍数要达到一定程度。通过对10份标本进行倍比稀释度后,用双抗原夹心一步法和二步法检测,用各浓度血清吸光度值(A)的均值与血清稀释度关系所做的曲线可看出,一步法在原倍及低稀释倍数也就是标本中待测抗体浓度较高时,吸光度值低;随着稀释倍数的增加吸光度值反而逐渐增高,到最适比时达到最高值,而后又逐渐降低,吸光度(A)值变化曲线呈“钟形”。而用二步法检测,吸光度(A)一直维持在较高水平,而当稀释度达一定倍数时,吸光度(A)值才逐渐下降,整个曲线呈倒的“S”形,这与蒋玉莲,朱浩稳等的报道相似[3]。
双抗原夹心二步法由于是抗体和酶标抗原分两步加入,因此不存在竞争抑制作用,可以避免钩状效应的产生。在本研究中,我们利用一步法试剂,先加入血清标本,37℃孵育30分钟,洗板后再加入酶标抗原,这样建立起来的二步法测定经一步法检测结果为阴性,而TPPA法检测为阳性的标本,其结果全部转为阳性,这说明了双抗原夹心二步法可以避免钩状效应的产生。虽然二步法可以避免钩状效应的产生,但却造成实验的敏感性降低[4],一些弱阳性标本会被漏检。
虽然双抗原夹心一步法在方法学上存在“钩状效应”的缺陷,但是由于其快速简便节约时间的优势,在我国仍然占据着很大的市场。为避免和消除钩状效应,我们可以用二步法、稀释法及TPPA或RPR 等方法做为补充,对临床一些可疑标本进行测定[5]。同时对于试剂厂家,应在固相和标记抗体或抗原的选择匹配上,采取结合位点远离或含多个可结合位点的方法,这样在很大程度上,可以避免或减轻“钩状效应”;另外也可充分混匀反应液,适当延长反应温育时间,则可使A、C和D复合物减少至最低程度,而减轻“钩状效应”的产生。
总之,本研究结果表明,TPELISA一步法检测梅毒特异性抗体存在钩状效应,在出现检测结果和患者病史及临床病表变现不一致的情况下,应该选择其他方法进行确认。
参考文献
[1]韦莹慧.早期梅毒实验室检查的现状[J].右江医学,2008,36(4):483-485.
[2]陈华根,刘 冰.规范使用“带现象”和“钩状效应”概念[J].中国输血杂志,2006,19(3):218.
[3]蒋玉莲,朱浩稳,赖 源,等. 酶联免疫吸附试验显色与样本含量的关系[J].现代检验医学杂志,2008,23(1):123.
[4]张京球,谭爱国,郭 健.TPELISA一步法检测梅毒螺旋体抗体钩状现象研究[J].中国实验诊断学,2007,11(11):1520.
[5]李金明.感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的确认[J].中华检验医学杂志, 2006,29(7):577.
(收稿日期:2009-05-01 修回日期:2009-07-31)
(编辑:梁明佩)
[关键词] 梅毒螺旋体;钩状效应;酶联免疫吸附试验
文章编号:1003-1383(2009)04-0421-03
中图分类号:R 446.61
文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.023
梅毒是由梅毒螺旋体(TP)感染引起的疾病,以性传播为主,也可以通过血液及母婴等形式传播。因此,对献血员、产妇、输血患者进行梅毒螺旋体感染的实验室检查具有非常重要的意义。我们选取10份临床可疑标本进行检测,就TP
ELISA中的“钩状效应”产生的原因和避免措施进行探讨。
材料和方法
1.血清标本来源本院住院和门诊病人中临床症状和病史疑似梅毒,血清TPELISA一步法检测阴性,TPPA试验检测阳性的标本10例。
2.试剂和仪器 TPELISA梅毒螺旋体抗体检测试剂盒为上海科华生物工程公司生产,TPPA试剂盒由日本富士瑞必欧株式会社提供。酶标仪和洗板机为雷杜公司的RT6000型和RT3000型。
3.方法 用TPELISA双抗原夹心一步法和二步法分别对样本的原液及稀释液进行检测。一步法按试剂盒说明书操作;二步法用一步法试剂先加血清样本,37℃孵育30分钟,洗板,再加酶标抗体。TPPA检测步骤按试剂说明书进行。
结果
1.用双抗原夹心一步法检测梅毒螺旋体特异性抗体阴性的10份可疑标本,用二步法检测,结果转为阳性;用TPPA检测也均为阳性,而且其效价均大于1∶1280,见表1。
表1 不同检测方法对样本的检测结果
标本号TPELISA一步法OD值结果
TPELISA两步法OD值结果TPPA
10.056- 0.122+1∶1280
20.034- 0.290+ 1∶1280
30.028- 0.322+1∶2560
40.043- 0.117+1∶2560
50.021- 0.671+1∶1280
60.045- 0.338+1∶5120
70.026- 1.147+1∶1280
80.024- 0.416+1∶1280
90.063- 0.134+1∶2560
100.064- 0.734+1∶2560
注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:阳性;“-”:阴性
2.分别用双抗原夹心一步法和二步法测定10份经过1∶2,1∶4…… 1∶2048倍比稀释的标本,10份标本各稀释度的吸光度(A)的均值见表2。两种方法测定的吸光度值与血清抗体浓度的关系见图1。用双抗原夹心一步法测定不同稀释度血清,吸光度值随着稀释倍数的增加逐渐升高,达到较高水平后又逐渐下降,曲线变化呈“钟形”;二步法则吸光度值开始维持在高值并无太大变化,而后随稀释度增加而逐渐下降,曲线呈倒“S”形。
3.TPELISA一步法和二步法对不同稀释度血清的抗体检出情况比较 一步法的漏检率呈两极现象。见表3。
表2 TPELISA一步法和二步法检测不同稀释度血清的吸光度均值
稀释度TPELISA一步法OD值结果
TPELISA二步法OD值结果
1∶20.012- 1.866+
1∶40.290+ 1.810+
1∶80.690+ 1.712+
1∶161.396+ 1.654+
1∶321.805+ 1.702+
1∶641.528+ 1.523+
1∶1281.151+ 0.789+
1∶2560.984+ 0.671+
1∶5120.416+ 0.447+
1∶10240.134+ 0.134+
1∶20480.077- 0.124+
注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:阳性;“-”:阴性
图1 TPELISA双抗原一步法和二步法检测不同稀释度血清的吸光度值变化曲线
表3 一步法和二步法对不同稀释度标本的检出情况
稀释倍数一步法阳性(N)阴性(N)
二步法阳性(N)阴性(N)一步法漏检率(%)
1∶1010 100100
1∶264 10040
1∶482 10020
1∶8100 1000
1∶16100 1000
1∶32100 1000
1∶64100 1000
1∶128100 1000
1∶256100 1000
1∶512100 1000
1∶102473 9130
1∶204864 8244
讨论
目前,针对梅毒的血清学检查主要包括TP特异性和非特异性抗体检测。梅毒非特异性抗体检测包括快速血清反应素环状卡片试验(RPR)和(TRUST)等;而对特异性抗体检测方法有:梅毒螺旋体血球凝集实验(TPHA),TPPA,免疫印迹实验(Western blot),荧光密螺旋体抗体吸附实验(FTAABS)及TPELISA等。TPPA,TPHA,免疫印迹,FTAABS虽然特异性很强,但因为成本较高,操作步骤烦琐而不适合对于大批量标本的检测。而ELISA法具有操作简单、用时短、灵敏度高和成本低廉等优点而普遍被各医疗机构卫生防疫部门以及血液中心采用,作为大批量标本梅毒抗体的筛查方法。TPELISA是利用基因工程合成的梅毒抗原,通过双抗原夹心法检测梅毒特异性抗体[1],主要包括TPELISA双抗原夹心一步法和二步法。TPELISA一步法因其具有操作简单、反应快速、敏感性高、结果易于判断及易于进行质量控制等优点被广泛采用,逐渐取代了RPR,成为医疗卫生机构和血站的梅毒筛选方法。但是,由于TPELISA一步法检测技术中“钩状效应”的存在,可以引起检测结果假阴性。因此,如何避免“钩状效应”,减少阳性病例的漏诊率成为目前研究的重点。
TPELISA法检测梅毒特异性抗体的方法主要包括:双抗原夹心法和间接法。双抗原夹心法主要检测梅毒特异性抗体IgG和IgM总抗体。双抗原夹心一步法测定梅毒特异性抗体是最常用的方法。其原理是在同一个ELISA检测体系中同时加入待测标本(含抗体)和酶标记抗原,形成的结合物包括:固相抗原+待测抗体(A), 固相抗原+待测抗体+酶标抗原(B),待测抗体+酶标抗原(C),酶标抗原+待测抗体+酶标抗原(D),在这4种结合物中,只有(B)结合物才是要测定的目的结合物。如果在反应体系中,待测的抗体浓度太高,由于竞争抑制作用,(C)和(D)类结合物增多,(B)类结合物减少,导致反应显色降低,甚至不显色,这就是所谓的“钩状效应”[2]。
在本研究中,通过采用TPELISA双抗原夹心一步法、二步法及TPPA检测10份可疑标本,结果表明,用双抗原夹心一步法检测为阴性的这10份标本,用二步法检测均转为阳性,TPPA检测结果也均为阳性,而且滴度均达到1∶1280以上;将10份标本再进行倍比稀释并同时用双抗原夹心一步法和二步法同时进行检测,稀释度在1∶2和1∶4时,一步法检分别有4例和2例检测结果仍为阴性,其余稀释度血清用双抗原夹心一步法和二步法检测,结果均为阳性,这说明了双抗原夹心一步法对高浓度抗体标本的检测是存在钩状效应的,而将存在钩状效应的标本经过稀释后可以消除,但是稀释的倍数要达到一定程度。通过对10份标本进行倍比稀释度后,用双抗原夹心一步法和二步法检测,用各浓度血清吸光度值(A)的均值与血清稀释度关系所做的曲线可看出,一步法在原倍及低稀释倍数也就是标本中待测抗体浓度较高时,吸光度值低;随着稀释倍数的增加吸光度值反而逐渐增高,到最适比时达到最高值,而后又逐渐降低,吸光度(A)值变化曲线呈“钟形”。而用二步法检测,吸光度(A)一直维持在较高水平,而当稀释度达一定倍数时,吸光度(A)值才逐渐下降,整个曲线呈倒的“S”形,这与蒋玉莲,朱浩稳等的报道相似[3]。
双抗原夹心二步法由于是抗体和酶标抗原分两步加入,因此不存在竞争抑制作用,可以避免钩状效应的产生。在本研究中,我们利用一步法试剂,先加入血清标本,37℃孵育30分钟,洗板后再加入酶标抗原,这样建立起来的二步法测定经一步法检测结果为阴性,而TPPA法检测为阳性的标本,其结果全部转为阳性,这说明了双抗原夹心二步法可以避免钩状效应的产生。虽然二步法可以避免钩状效应的产生,但却造成实验的敏感性降低[4],一些弱阳性标本会被漏检。
虽然双抗原夹心一步法在方法学上存在“钩状效应”的缺陷,但是由于其快速简便节约时间的优势,在我国仍然占据着很大的市场。为避免和消除钩状效应,我们可以用二步法、稀释法及TPPA或RPR 等方法做为补充,对临床一些可疑标本进行测定[5]。同时对于试剂厂家,应在固相和标记抗体或抗原的选择匹配上,采取结合位点远离或含多个可结合位点的方法,这样在很大程度上,可以避免或减轻“钩状效应”;另外也可充分混匀反应液,适当延长反应温育时间,则可使A、C和D复合物减少至最低程度,而减轻“钩状效应”的产生。
总之,本研究结果表明,TPELISA一步法检测梅毒特异性抗体存在钩状效应,在出现检测结果和患者病史及临床病表变现不一致的情况下,应该选择其他方法进行确认。
参考文献
[1]韦莹慧.早期梅毒实验室检查的现状[J].右江医学,2008,36(4):483-485.
[2]陈华根,刘 冰.规范使用“带现象”和“钩状效应”概念[J].中国输血杂志,2006,19(3):218.
[3]蒋玉莲,朱浩稳,赖 源,等. 酶联免疫吸附试验显色与样本含量的关系[J].现代检验医学杂志,2008,23(1):123.
[4]张京球,谭爱国,郭 健.TPELISA一步法检测梅毒螺旋体抗体钩状现象研究[J].中国实验诊断学,2007,11(11):1520.
[5]李金明.感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的确认[J].中华检验医学杂志, 2006,29(7):577.
(收稿日期:2009-05-01 修回日期:2009-07-31)
(编辑:梁明佩)