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摘 要：基因组编辑技术发展迅速，已成为植物抗病育种的重要手段之一。近年来，CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律间隔成簇短回文重复序列）技术由于设计和操作简单、成功率高、通用性强、成本低以及遗传编辑之后不会造成外源基因污染等优点，被广泛应用于植物抗病基因改良。CRISPR由几个不连续的直接重复序列组成，具有切除入侵病毒和外源DNA，保护自身免受侵染的功能。本文综述了CRISPR技术在单子叶植物（水稻、小麦、玉米、香蕉）和双子叶植物（拟南芥、烟草、番茄）抗病基因改良中的应用，讨论其优缺点并展望其应用前景，以便促进该技术在改良植物抗病性中的应用。
关键词：CRISPR技术;抗病性;基因编辑
中图分类号：S332.2
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）04-0046-12
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.007
Abstract：With the rapid development of genome editing technology，it has become one of the important means of plant disease resistance breeding.In recent years，CRISPR technology has been widely used in plant disease resistance gene improvement due to its advantages of simple design and operation，high success rate，strong versatility，low cost，and no pollution of exogenous genes after genetic editing.CRISPR consists of several discontinuous direct repeat sequences，which have the function of removing invading viruses and foreign DNA and protecting itself from infection.This paper reviewed the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance genes of monocotyledons （rice，wheat，maize，banana） and dicotyledons （Arabidopsis thaliana，tobacco，tomato），discussed its advantages and disadvantages，and prospected its application prospect，so as to promote the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance of plants.
Keywords：CRISPR technology; disease resistance;gene editing
全球的粮食问题一直以来都是被广泛关注的焦点，尽管造成粮食产量损失的因素很多，但作物病害的普遍发生却一直都是限制其生产的主要因素之一[1-2]。作物易受各种真菌、细菌和病毒的侵染，而造成巨大的产量损失[3]。随着科学研究的不断深入，增强作物抗病性已被证实是病害防治的重要方法之一[4-5]。近年来基因组编辑技术发展迅速，已成为增强植物抗病性的重要手段之一[2，4，6]。基因组编辑技术依靠基因工程核酸酶切割特定的DNA序列来产生特定位点的双链断裂（double strand breaks，DSBs），使DNA通过非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）被修复，这一过程常常导致碱基替换、插入和缺失以及相关基因的突变。其方法主要包括利用巨核酸酶、锌指核糖核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）进行定点修饰[3，5，7-8]。
不同于ZFN和TALEN技术操作的复杂性及耗时性，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术只需要改变20 bp的gRNA便可靶向不同的基因[6，9]。除了用于动物中的抗病毒研究，近年来，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术同样也被应用于植物的抗病育种中[7，10]。由于CRISPR/Cas9系统具有设计和操作简单、成功率高、通用性强、成本低、遗传编辑之后不留有外源基因污染等优点[1，4，7，9]。此外，研究发现利用CRISPR/Cas9技术诱导产生DSB（双链断裂）和双生病毒（植物病毒家族，具有单链环状DNA基因组，宿主范围广泛，可作为HDR过程中的修复模板）载体，可获得足量供体DNA导入细胞，提高靶向KI（基因敲入）效率[11-13]。上述研究使CRISPR/Cas9基因组编辑技术的使用率在很大程度上已经超过其他基因组编辑技术，成为科学家所掌握的对基因组进行精确编辑的最有效的工具[4，14]。2020年10月7日，瑞典皇家科学院将2020年诺贝尔化学奖授予Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，以表彰她們发现CRISPR / Cas9基因剪刀，在基因组编辑领域做出了巨大的贡献。CRISPR于1987年在大肠杆菌中被首先发现，之后研究人员接连在各种细菌和古细菌的基因组中观察到了相似的结构，于2002年正式提出了CRISPR的概念[3，15-17]。CRISPR具有为自身提供特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件入侵的功能[2，4，18]，还会与Cas蛋白结合形成CRISPR/Cas系统，能对目标基因进行准确的直接修饰[19]。本文将从CRISPR技术在植物抗病基因改良中的应用入手，讨论其优缺点，并展望CRISPR在植物抗病基因改良中的应用前景。 1 CRISPR及组成
CRISPR由两部分组成，即CRISPR基因座和由Cas蛋白家族编码的基因[20-21]。其中CRISPR基因座由前导序列 （Leader Sequence）、CrRNA （CRISPR RNA）和一系列高度保守的重复序列（Repeat）与随机的间隔序列 （Spacer）交替排列组成（图1）[7，22-23]。Cas系列蛋白编码基因以操纵子的形式排列，具有间隔区获得、CrRNA加工、靶点切割和其他辅助作用 [24-27]。CRISPR/Cas系统主要通过获得性免疫，抵抗病毒和外源 DNA的入侵 [22，25]。由于Cas基因的核心元件序列各不相同，CRISPR/Cas系统可以分为三种不同的类型（I型、II型和III型）[26，28]。但这三种不同类型的系统都包含两个通用基因：Cas1（不具有序列特异性的金属依赖性DNA酶，可能参与外源DNA的侵入过程）和Cas2（金属依赖性内核糖核酸酶，可能参与间隔区的获得過程）[20，27，29]，且各具有一个独特的特征基因，分别为Cas3（可编码具有独立的解旋酶和DNA酶活性的大蛋白和可能形成具有不同组成的级联状复合物的蛋白质的基因）、Cas9（含有RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域的大蛋白）和Cas10（含有与核酸聚合酶和核苷酸环化酶结构域同源的结构域的蛋白） [30-35]。因此，这三种系统的功能及操作方式具有相似性但又有所不同，例如三种系统的功能都主要依赖于crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA （Trans-activating chimeric RNA） 结合形成的双元复合体引导Cas（CRISPR-associated system） 蛋白对外源 DNA 进行序列特异性降解[36-40]，但在对DNA双链进行切割时，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体才能操作，而Ⅱ型则只需要1个Cas9蛋白即可完成[28，39]。
不同于传统植物基因编辑技术，植物CRISPR/Cas9系统可以通过一个双元载体的T-DNA构建多个sgRNA 表达盒，并使每种sgDNA携带不同的靶序列或利用前体tRNA剪切产生多种sgDNA[41-45]，实现同时对多个基因位点的编辑，大大提高了基因编辑的效率。因而，CRISPR/Cas9系统比其他两种系统使用的更广泛。如今CRISPR/Cas9系统已被应用到拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组编辑的研究中 [20，25，29，35，40]，已成为现今公认的增强作物抗病性的重要手段之一（图1）。而由CRISPR/Cas9系统衍生的一系列基因编辑技术，如利用CRISPR/Cas系统构建RGNs系统（由RNA引导核酸酶（RGNs）在特定的位置使DNA双链断裂（DBS））修复序列的方法也已被广泛用于靶向基因组的编辑中[46-48]。
2 CRISPR技术在单子叶植物抗病中的应用
2.1 CRISPR技术在水稻抗病中的应用
2.1.1 CRISPR技术在防治水稻真菌病害中的应用——以水稻稻瘟病为例
水稻（Oryza sativa L.）为世界三大粮食作物之一，为单子叶模式植物[49]，如其他许多作物一般易受自然界各种病原物的侵染，而导致每年产量损失巨大，因而对其进行分子生物学研究意义重大[50，57]。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的一种破坏性极强的真菌病害，是水稻三大病害之一[49，58]。稻瘟病可以发生在水稻生长的任何时期，在我国已多次发生[51，59]。经过多年的研究，抗性育种已被证实是防治该病害最有效的方法。由于稻梨孢具有小种变异快的特点，导致稻瘟病抗性品种在3～5年的田间种植之后就会丧失抗性[52-54]。在传统的水稻抗病育种中，诱变育种和杂交育种是主要的育种方法[33]。通过人工选择和抗性鉴定，将抗稻瘟病品种的抗性基因导入水稻植株，从而培育出抗稻瘟病新品种[55]。该方法周期长、成功率低，已无法有效控制稻瘟病的发生[56]。
目前，CRISPR/Cas9 基因编辑技术已在编辑水稻Pita、Pi21、Pi20、ERF922和bsr-d1等稻瘟病抗性相关基因方面得到应用[51，60，62，66]。经PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）鉴定及效率分析和对突变体稻瘟病的抗性鉴定发现，靶位点存在多种突变类型，且突变率较高，突变体的抗性明显高于野生型，即证明利用CRISPR/Cas9技术进行抗稻瘟病育种的方法可行[49，53，61]。此外，随着序列特异性核酸酶（Sequence specific nuclease，SSNs）的发现和应用，CRISPR/Cas9已被证实是最有效的SSNs[62-63]。以CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）为主的水稻抗稻瘟病的工程已成功改良水稻OsERF922基因（抗稻瘟病负调控因子），大大增强了水稻对稻瘟病的抗性[53，64-66]，为培育水稻抗稻瘟病新品种带来了新的机遇。
2.1.2 CRISPR技术在防治水稻细菌病害中的应用——以水稻白叶枯病为例
水稻黄单胞菌水稻致病变种Xoo（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）是水稻白叶枯病的致病菌[67]。水稻白叶枯病是危害世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一[68]。Xoo 主要通过水稻叶片上的伤口或水孔侵入水稻维管束生长和大量增殖，阻塞维管束，从而导致水稻死亡[60，71]。已有研究证明，利用CRISPR/Cas9系统可敲除水稻Os8N3或SWEET13基因，增强水稻对Xoo的抗性[69-70]。利用CRISPR技术过对水稻OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWET14三个敏感基因进行靶向编辑，已成功获得具有广谱抗白叶枯病性的水稻新品种[72-74]。而利用Cas9/sgRNA构建水稻原生质体细胞，以Xoo易感性基因OsSWEET14和OsWEET11启动子区为靶点，即可培育对白叶枯病有抗性的水稻新品种[54，73，75]。 2.1.3 CRISPR技术在防治水稻病毒病中的应用
植物病毒可引发多种病害，其对农业生产造成巨大损失[76]。CRISPR来源于细菌和古生菌的基因组，其最初的功能是为细菌提供抗外源病毒的特异性免疫保护机制，因此也可用于植物抗病毒性的研究[3，6，11，17]。根据植物病毒需要在宿主细胞中进行繁殖的特性[77]，研究人员利用CRISPR技术在病毒侵染的关键时期对宿主细胞进行定向编码，即可获得抗病毒植株[4，36，38]。例如，借助CRISPR/Cas9技术定向编码产生的水稻eIF4G基因对水稻东格鲁球形病毒（与水稻东格鲁杆状病毒共同作用引起水稻东格鲁球形病毒病）具有抗性[78-80]，可用于水稻抗东格鲁球形病毒病（热带亚洲水稻生产的一个严重制约因素）育种[79]。此外，研究发现通过CRISPR技术分别靶向南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）双链RNA基因组的crRNA（CRISPR-derived RNA）和水稻条纹花叶病毒（RSMV）单链RNA基因组的crRNA，构建的转基因水稻植株分别对SRBSDV和RSMV有很好的抗性，即证明特异性靶向病毒基因组的crRNA-LshCas13a，使其过度表达是一种有效的抗RNA病毒的途径[80-85]。
2.2 CRISPR技术在小麦抗病基因改良中的应用——以小麦白粉病为例
小麦是世界三大谷物之一，在世界各地广泛种植[86]。小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis）引起的，其主要危害小麦叶片，而使小麦产量受损[154-155]。虽早有研究报道抗性育种为防治该病害最重要的方法之一[87-88]。但由于小麦关键基因的拷贝较多，致使育种过程需要的时间过长[89-90]。所以在使用传统育种方法已成功培育出抗性水稻品种时，小麦的抗性育种却一直没有进展。而如今得益于基因编辑技术的发展，研究发现利用CRISPR/Cas9技术对小麦某些负调控基因（如：RESISTANCE1（EDR1））进行编辑[91-93]，使这些基因控制的性状在不同程度上得到改良，即可获得抗病、抗逆性品种[94]。此外，研究发现了3个TaMLO同源基因的突变可使小麦对白粉病产生广谱抗性[95-96]，高彩霞课题组已于2014年利用CRISPR基因编辑技术成功修改了六倍体小麦的DNA，培育出抗白粉病小麦品种（Taedr1）[94，97]。
2.3 CRISPR技术在玉米抗病基因改良中的应用——以双生病毒病为例
玉米（Zea mays L.）是优良的粮食作物，被广泛种植于热带和温带地区，具有极好的环境适应性[98]。由于与传统的粮食作物小麦、水稻等相比玉米的种植环境大都比较恶劣，所以对玉米基因组的研究虽早已开展，但都主要集中于抗逆品种的培育及对其农艺性状的改良方面[99-100]。例如，利用CRISPR/Cas9 技术编辑ARGOS8（乙烯负调控因子）基因使其过量表达，可成功培育出抗旱高产的玉米[101]。而CRISPR技术在玉米抗病基因改良中的应用，目前则主要集在于利用CRISPR/Cas9系统培育抗双生病毒病（常发生于热带和亚热带地区，可使玉米植株畸形，穗部细小，对其产量造成严重影响）品种的研究中[102-104]，如培育玉米条斑病的抗性育种，现已发现Cas9蛋白和sgRNAs的过度表达可抑制双生病毒基因组的复制，为玉米抗性育种的开展提供了基础[105-107]。
2.4 CRISPR技术在香蕉抗病基因改良中的应用——以病毒病为例
作为重要的经济作物之一，香蕉（Musa nana Lour.）的生产常受香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV）的影响[108]。該病毒可将自身的基因组整合到宿主的基因组中形成内源BSV（eBSV），在胁迫条件下eBSV会活化对植物体进行感染[109]。香蕉全基因组序列的已知加上再生和遗传转化体系的建立，使基因编辑技术在香蕉上得到广泛应用[110]。但由于在香蕉主栽品种中存在整合的eBSV，使得香蕉种质资源的保存和杂交育种的进行依旧充满挑战[109，111]。据报道肯尼亚科学家团队利用CRISPR/Cas9技术定向编辑eBSV，使其失活，已成功阻止感染性病毒颗粒[112]。相信随着研究的深入，将来即可通过CRISPR/Cas9的靶向基因编辑永久地灭活内源性eBSV，成功培育出抗条斑病毒的香蕉品种[113]。
此外，研究发现利用CRISPR/Cas9技术编辑香蕉eIF基因家族可获得对香蕉束顶病毒属（Babuvirus）的抗性[114];还可激活香蕉的内源性防御基因，如抗病基因、致病相关基因、受体激酶和抗菌蛋白等[108，115]。如今，通过对抗病野生香蕉和感病香蕉转录组学的研究，已成功找到了香蕉抗细菌病的靶基因[116]。使用CRISPR技术敲除单个或多个易感基因（如MLO13、DMR6）、转运蛋白基因（如SWEET14）和负性调节因子（如E3泛素连接酶）可使香蕉对香蕉细菌性枯萎病菌产生抗性[117-119]。
3 CRISPR技术在双子叶植物抗病中的应用
3.1 CRISPR技术在拟南芥抗病基因改良中的应用
拟南芥为双子叶模式植物，素有“植物中的果蝇”之称，是进行遗传学研究的好材料[7]。研究人员在利用CRISPR/Cas9系统对拟南芥进行基因编辑时发现：通过对叶片组织进行的绿色荧光信号标记，成功在后代中检测到被修饰基因的遗传，且在F2代中仍有50%修饰[120-121]，证实由CRISPR/Cas9系统编辑的基因具有可稳定遗传的特性，可用于抗性品种的培育。加之发现拟南芥受病原物侵染时DMR6突变体（与水杨酸（SA）稳态相关基因缺失形成）的数量会增加，并与DLO1基因（DMR6同源基因）协同合作，积累SA（SA水平的提高是产生抗性的基础）激活植物的免疫功能，而使拟南芥产生抗性[72，122-124]。且在双子叶植物番茄、马铃薯等中都观察到了类似可产生抗性的基因，使CRISPR技术得以在双子叶植物抗病中得以广泛应用[12]。 近年发现的利用CRISPR/Cas13（Cas13酶，能特异性编辑RNA但不改变基因组）技术在拟南芥中构建抗RNA病毒的CRISPR/Cas系统的方法，已成功应用于原核生物中抵御RNA和DNA病毒[126]。而使用CRISPR/LshCas13a系统构建转基因拟南芥植株，以干扰芜菁花叶病毒（TuMV）RNA基因组实验的成功[80，83，85]。证实利用CRISPR / Cas13系统抗病毒策略的可行性，为双子叶植物病毒病的防治提供了又一方案。
3.2 CRISPR技术在烟草抗病基因改良中的应用
烟草是世界范围内重要的经济作物之一，因其品质极易受化学农药及其他物理因素（温度、水分等）的影响，烟草的抗病育种研究显得尤为重要[127-128]。目前，通过ZFN和TALENs，已成功靶向中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）、烟草卷曲茎病毒 （tobacco curly shoot virus，TbCSV）、烟草曲茎病毒（TbCSV）和云南番茄曲叶病毒（tomato leaf curl Yunnan virus，TLCYnV）基因，赋予了转基因烟草对这四种病毒的部分抗性[76-77]。此外，研究发现通过CRISPR/Cas9系统定向编辑双生病毒基因组，可提高烟草对双生病毒的抗性[129];CRISPR/FnCas9系统可有效抑制黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒在植物中的复制;C2c2（一种靶向RNA的新型CRISPR系统）可以切割单链RNA[130]，干扰芜菁花叶病毒在植物中的复制;利用CRISPR/Cas9技术敲除Va基因（单隐性基因，决定烟草对马铃薯Y病毒（PVY）的易感性），可培育抗PVY烟草植株[131]。研究人员利用来自新凶手弗朗西丝菌（Francisella novicida）的CRISPR/Cas9系统和沙氏纤毛菌（Leptotrichia shahii）的 CRISPR/Cas13a 系统，成功赋予了烟草对RNA病毒的抗性，实现了广谱抗病毒的目标[132]。
由青枯雷尔氏杆菌（Ralstonia solanacearum （E.F.Smith） Yabuuchi et al.）引起的烟草青枯病，是对世界烟草产业具有重要影响的细菌性病害[133]。目前，已有研究证实烟草VQ基因家族（植株中广泛存在的一类调节因子）与烟草对青枯病的抗性有关，利用CRISPR/Cas9技术编辑获得的NtVQ35基因的植株对青枯病菌有负向调控作用[134]，且不会影响植株正常的生长和表型变化，可用于烟草抗青枯病育种。
3.3 CRISPR技术在番茄抗病基因改良中的应用
番茄（Solanum lycopersicum）为茄科植物，是世界上最重要的农作物之一，也是世界上第二大消费蔬菜[135]，具有重要的经济价值，因长期受植物病原菌（如丁香假单胞菌、黄单胞属菌和疫霉属菌物）的影响而损失巨大[136]。基于对其基因组研究工作的进行，目前已成功在番茄基因组中鉴定出一个DMR6的同源基因（SlDMR6-1）[72]，利用CRISPR/Cas9系统构建番茄SlDMR6-1基因缺失植株结果显示：该基因对多种植物源菌物具有活性，且对植物的生长发育无明显影响，即证明可利用该技术进行抗病性番茄的培育[137]。目前，利用CRISPR/Cas9技术对番茄中的广谱抗白粉病mlo隐性突变基因的研究[138]及抗番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的植株的培育工作正在顺利进行中[81]。
此外，在利用CRISPR技术对大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）的研究取得成功后，已开始在番茄和马铃薯晚疫病（一种毁灭性的病害）病原菌致病疫霉（P.infestans）中建立CRISPR/Cas9系统[139]。并成功在四倍体马铃薯中鉴定出提高马铃薯晚疫病抗性的基因（StDMR6-1和StCHL1），使马铃薯的抗性育种得以突破[140]。
4 CRISPR技术在应用过程中存在的问题
如今，CRISPR/Cas9 系统的应用十分广阔[76]，已成为实现提高作物的产量、持续抗性及优良品质等育种目标的重要工具[43，56，75]。尽管如此，现阶段CRISPR技术在应用过程中仍存在很多问题，主要包括：（1）还有许多植物由于有效遗传转化体系难以建立而无法开展大规模 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的研究[13，25];（2）虽然对许多植物，特别是农作物的全基因组测序工作現在已经完成。然而，决定许多重要性状的主效基因仍尚未发现或得到鉴定，这限制了 CRISPR/Cas9 技术在植物基因工程育种中的应用[39，42，141];（3）CRISPR系统对PAM序列的要求严格导致可以编辑的序列数较低、来源不同的Cas9基因和不同的靶位点导致突变效率不同[59，62，142]、植物中同源重组（homologous recombination，HR）的效率很低、这些因素都在一定程度上限制基因组的编辑效率[123];（4）存在脱靶现象，靶位点专一性有待提高[143-144];（5）目前的研究主要集中在利用CRISPR/ Cas9 技术破坏靶基因的功能上。而对如何利用 HDR（homology-directed repair，同源定向修复） 在基因组靶位点引入相关功能基因的研究较少，使得一些应用的预期受到阻碍，如基因替换和大规模染色体缺失的基因工程[78-79];（6）突变植株在自然环境条件下的表现仍具有不确定性，不能直接在自然环境中获得经过基因组编辑的植物;（7）由于在使用CRISPR/Cas9技术编辑作物基因组时仍需要借助转基因的技术手段，且突变植株在自然环境条件下的表现仍具有不确定性，而对该技术是否属于转基因范畴以及是否应该按照转基因的管理办法来进行监管仍具有争议[14，16]。 5 展望
從目前的研究来看，CRISPR/Cas9技术的应用较其他基因编辑技术更广泛主要得益于：（1）靶位点具有广泛性：CRISPR/Cas9编辑技术所需的具有NGG的PAM序列的靶位点，在基因组中广泛存在，因此CRISPR/Cas9系统的应用广泛[60，70，151];（2）靶位点特异性高：在单子叶模式植物——水稻中的脱靶率低，在双子叶模式作物——拟南芥和烟草中没有发现脱靶现象[78，144];（3）载体组装过程简便;（4）遗传编辑之后不会造成外源基因污染现象，提高了人们对“烟草”等因为国际贸易限制而不允许转基因作物的接受程度[54，57，150];（5）由于双元载体T-DNA结构的存在，可实现同时对多个基因位点的编辑;（6）由CRISPR介导的植物抗病基因改良在某些情况下对多种病原体具有广谱抗性[37，152];（7）通过CRISPR系统作用产生抗性的植物不仅仅局限于试验研究及温室，一些CRISPR作物品种已开始商业化，如：含强化欧米伽-3油的亚麻荠（Camelina sativa （L.） Crantz）已进入美国市场[2，67，149];（8）CRISPR/Cas9技术在基因表达调控，表观遗传学、基因座定位和染色体结构研究及基因功能筛选等方面的研究中也可发挥重要作用。
此外，该技术在其他（植物技术方面也显示出良好的应用前景。例如，采用新生分生组织编辑双子叶植物的基因可省略耗时的组织培养步骤[146];使用耐温CRISPR/LbCas12a可以提高靶向性和突变效率，实现在水稻基因组中精确插入DNA序列[81];应用热诱导CRISPR系统可以提高玉米基因识别靶标的效率[82];由Cas9蛋白的两个切割结构域发生突变与sgRNA形成复合物，具有RNA干扰的作用[8]等。当然，目前关于CRISPR/Cas9系统仍有许多亟待解决的问题，为使其得到更好的应用，研究者已开始着手进行解决。例如，CRISPR技术在基因编辑方面存在的脱靶和靶位点专一性较低的问题[147]。目前已经有专业的软件，如Cas-OFFinder、SureDesign（由安捷伦公司开发）等，用于寻找 CRISPR/Cas9靶位点、设计sgRNA[148]。还可根据各种影响因素对突变频率的影响，提示软件用户避开可能脱靶的位点、选择突变效率较高的位点[149，153]。由病毒诱导的 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统的开发，使CRISPR/Cas9系统的脱靶率大幅度较低。作为一种新的基因组编辑技术，CRISPR-Cas9系统正在面对着全球粮食生产的危机，目前大量粮食作物的高产、优质、抗逆性育种发展已进入瓶颈期，是机遇也是巨大的挑战。随着越来越多的研究人员和实验室的加入，CRISPR/Cas9 技术将在这个充满各种挑战和诱惑的后基因组时代变得更加有用，在未来得到更广泛的应用。
参 考 文 献：
[1] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product.[J].Journal of Bacteriology，1987，169（12）：5429-33.
[2] TIAN J，XU G，YUAN M.Towards Engineering broad-spectrum disease-resistant crops[J].Trends in Plant Science，2020，25（5）：424-427.
[3] LI S，SHEN L，HU P，et al.Developing disease-resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene editing[J].Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（12）：1201-1205.
[4] PIXLEY K V，FALCK-ZEPEDA J B，GILLER K E，et al.Genome editing，gene drives，and synthetic biology：will they contribute to disease-resistant crops，and who will benefit？[J].Annual Review of Phytopathology，2019，57：165-188
[5] BIKAL G.Use of Crispr/Cas9 for development of disease resistant cultivars in plant breeding[J].International Journal of Applied Sciences and Biotechnology，2017，5（4）：403-409.
[6] KHLESTKINA E K，SHUMNY V K.Prospects for application of breakthrough technologies in breeding：The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing[J].Russian Journal of Genetics，2016，52（7）：676-687.
[7] HORVATH P，BARRANGOU R.CRISPR/Cas，the immune system of bacteria and archaea[J].Science，2010，327（5962）：167-170. [8] 林萌萌，李春娟，闫彩霞，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用[J].核农学报，2021，35（6）：1329-1339.
[9] HAFT D H，SELENGUT J，MONGODIN E F，NELSON K E.A guild of 45 CRISPR-associated （Cas） protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J].Plos Computational Biology，2005，1（6）：474-483.
[10] 姚祝平，程远，万红建，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用[J].分子植物育种，2017，15（7）：2647-2655.
[11] 曾秀英，侯学文.CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用[J].植物生理学报，2015，51（9）：1351-1358.
[12] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.
[13] PYZOCHA N K，CHEN S.Diverse class 2 CRISPR-Cas effector proteins for genome engineering applications[J].ACS Chemical Biology，2018，13（2）：347-56.
[14] 单奇伟，高彩霞.植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J].遗传，2015，37（10）：953-973.
[15] 汪莲，王浩君，罗云孜.CRISPR技术在微生物合成生物学中的应用[J].生命科学，2019，31（5）：493-507.
[16] KOONIN E V，MAKAROVA K S，ZHANG F.Diversity，classification and evolution of CRISPR-Cas systems[J].Current Opinion in Microbiology，2017，37：67-78.
[17] SHMAKOV S A，SITNIK V，MAKAROVA K S，et al.The CRISPR spacer space ss dominated by sequences from species-specific mobilomes[J].mBio，2017，8（5）：1-18.
[18] MAKAROVA K S，ARAVIND L，WOLF Y I，et al.Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems[J].Biology Direct，2011，6（1）：1-27.
[19] MAKAROVA K S，HAFT D H，BARRANGOU R，et al.Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J].Nature reviews microbiology，2011，9（6）：467-477.
[20] 景潤春，卢洪.CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J].中国农业科学，2016，49（7）：1219-1229.
[21] 刘耀光，李构思，张雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J].华南农业大学学报，2019，40（5）：38-49.
[22] 解莉楠，宋凤艳，张旸.CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J].中国农业科学，2015，48（9）：1669-1677.
[23] BOYD L A，RIDOUT C，O’SULLIVAN D M，et al.Plant-pathogen interactions：disease resistance in modern agriculture[J].Trends in Genetics，2013，29（4）：233-240.
[24] BORRELLI V M G，BRAMBILLA V，ROGOWSKY P，et al.The enhancement of plant disease resistance using CRISPR/Cas9 technology[J].Frontiers in Plant Science，2018，9：1245.
[25] BOONTAWON T，NAKAZAWA T，INOUE C，et al.Efficient genome editing with CRISPR/Cas9 in Pleurotus ostreatus[J].AMB Express，2021，11（1）：1-11.
[26] ZHANG Y，SHOWALTER A M.CRISPR/Cas9 genome editing technology：A valuable tool for understanding plant cell wall biosynthesis and function[J].Frontiers in Plant Science，2020，11：1-14. [27] BARMAN A，DEB B，CHAKRABORTY S.A glance at genome editing with CRISPR-Cas9 technology[J].Current Genetics：Microorganisms and Organelles，2020，66（12）：447-462.
[28] 马兴亮，刘耀光.植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J].遗传，2016，38（2）：118-125.
[29] 刘婷婷，范迪，冉玲玉，等.应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因[J].遗传，2015，37（10）：1044-1052.
[30] VEILLET F，DURAND M，KROJ T，et al.Precision breeding made real with CRISPR：Illustration through genetic resistance to pathogens[J].Plant Communications，2020，1（5）：100102.
[31] DAS A，SHARMA N，PRASAD M.CRISPR/Cas9：A novel weapon in the arsenal to combat plant diseases[J].Frontiers in Plant Science，2019，9：2008.
[32] ZAIDI S S，MUKHTAR M S，MANSOOR S.Genome editing：Targeting susceptibility genes for plant disease resistance[J].Trends in Biotechnology，2018，36（9）：898-906.
[33] 常振仪，严维，刘东风，等.CRISPR/Cas技术研究进展[J].农业生物技术学报，2015，23（9）：1196-1206.
[34] LANGNER T，KAMOUN S，BELHAJ K.CRISPR Crops：Plant genome editing toward disease resistance[J].Annual Review of Phytopathology，2018，56：479-512.
[35] TYAGI S，KUMAR R，KUMAR V，et al.Engineering disease resistant plants through CRISPR-Cas9 technology[J].GM Crops & Food，2021，12（1），125-144.
[36] ZAIDI S S，MAHAS A，VANDERSCHUREN H，et al.Engineering crops of the future：CRISPR approaches to develop climate-resilient and disease-resistant plants[J].Genome Biology，2020，21（1）：289.
[37] 平文丽，李雪君，林娟，等.CRISPR/Cas9介导的基因組编辑技术及其在作物品种改良中的应用[J].中国农学通报，2016，32（5）：16-22.
[38] 冷春旭，闫平，吴立成，等.CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用[J/OL].分子植物育种，2021，1-13.
[39] JIN S，ZONG Y，GAO Q，et al.Cytosine，but not adenine，base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J].Science，2019，364（6437）：292-295.
[40] 顾爽，郑文静，马殿荣.CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻育种应用的研究进展[J/OL].分子植物育种，2020，1-11.
[41] WANG M，MAO Y，LU Y，et al.Multiplex gene editing in rice with simplified CRISPR-Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems[J].Journal of Integrative Plant Biology，2018，60（8）：626-631.
[42] ZHOU J，DENG K，CHENG Y，et al.CRISPR-Cas9 based genome editing reveals new insights into MicroRNA function and regulation in rice[J].Frontiers in Plant Science，2017，8：8：1598.
[43] ZAYNAB M，SHARIF Y，FATIMA M，et al.CRISPR/Cas9 to generate plant immunity against pathogen[J].Microbial Pathogenesis，2020，141：103396.
[49] 徐鹏，王宏，涂燃冉，等.利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性[J].中国水稻科学，2019，33（4）：313-322.
[50] 唐秀英，王会民，龙起樟，等.CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用[J].分子植物育种，2017，15（3）：895-902. [51] 李伟滔，朱紫薇，尹俊杰，等.水稻“抗癌”新因子bsr-d1[J].自然杂志，2018，40（2）：131-135.
[52] 王加峰，郑才敏，刘维，等.基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建[J].作物学报，2016，42（8）：1160-1167.
[53] WANG F，WANG C，LIU P，et al.Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J].PLoS ONE，2016，11（4）：1-18.
[54] LIU M，SHI Z，ZHANG X，et al.Author correction：inducible overexpression of ideal plant architecture1 improves both yield and disease resistance in rice[J].Nature Plants，2019，5（8）：389-400.
[55] ASHKANI S，RAFII M Y，SHABANIMOFRAD M，et al.Molecular breeding strategy and challenges towards improvement of blast disease resistance in rice crop[J].Frontiers in Plant Science，2015，6（866）：1-14.
[56] SINGH P K，NAG A，ARYA P，et al.Prospects of understanding the molecular biology of disease resistance in rice[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（4）：1-39.
[57] FOSTER A J，MARTIN-URDIROZ M，YAN X，et al.CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein-mediated co-editing and counterselection in the rice blast fungus[J].Scientific Reports，2018，8（1）：1-12 .
[58] YAMATO T，HANDA A，ARAZOE T，et al.Single crossover-mediated targeted nucleotide substitution and knock-in strategies with CRISPR/Cas9 system in the rice blast fungus[J].Scientific Reports，2019，9（11）：1-8.
[59] ARAZOE T，MIYOSHI K，YAMATO T，et al.Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus[J].Biotechnology and Bioengineering，2015，112（12）：2543-2549.
[60] MA X，ZHANG Q，ZHU Q，et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J].Molecular Plant，2015，8（8）：1274-1284.
[62] 卿冬進，邓国富，戴高兴，等.利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体[J].分子植物育种，2020，18（16）：5343-5350.
[63] HU X，CUI Y，DONG G，et al.Using CRISPR-Cas9 to generate semi-dwarf rice lines in elite landraces[J].Scientific Reports，2019，9（1）：1-7.
[64] FIAZ S，AHMAD S，NOOR M A，et al.Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement：Perspectives and Opportunities[J].International Journal of Molecular Sciences，2019，20（4）：1-18.
[65] LU Y，TIAN Y，SHEN R，et al.Targeted，efficient sequence insertion and replacement in rice[J].Nature Biotechnology，2020，38：1402-1407.
[66] 吴凡，王月，陈闽，等.基于CRISPR/Cas9技术的水稻抗稻瘟病基因Pita突变体的创制[J].植物资源与环境学报，2020，29（2）：1-7.
[67] LI C，LI W，ZHOU Z，et al.A new rice breeding method：CRISPR/Cas9 system editing of the Xa13 promoter to cultivate transgene-free bacterial blight-resistant rice[J].Plant Biotechnology Journal，2020，18（2）：313-315. [69] KIM Y-A，MOON H，PARK C-J.CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae[J].Rice，2019，12（1）：1-13.
[70] ZENG X，LUO Y，VU N T Q，et al.CRISPR/Cas9-mediated mutation of OsSWEET14 in rice cv.Zhonghua11 confers resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae without yield penalty[J].BMC Plant Biology，2020，20（1）：1-11.
[71] 郝巍，紀志远，郑凯丽，等.利用基因组编辑技术创制水稻白叶枯病抗性材料[J].植物遗传资源学报，2018，19（3）：523-530.
[72] 李希陶，刘耀光.基因组编辑技术在水稻功能基因组和遗传改良中的应用[J].生命科学，2016，28（10）：1243-1249.
[73] 刘欣欣，李赫，卜庆云，等.CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用[J].土壤与作物，2021，10（1）：18-26.
[74] 沈明晨，薛超，乔中英，等.CRISPR/Cas9系统在水稻中的发展和利用[J].江苏农业科学，2019，47（10）：5-10.
[75] 郑凯丽，纪志远，郝巍，等.水稻白叶枯病感病相关基因Xig1的分子鉴定及抗病资源创制[J].作物学报，2020，46（9）：1332-1339.
[76] KALININA N O，KHROMOV A，LOVE A J，et al.CRISPR Applications in plant virology：Virus resistance and beyond[J].Phytopathology，2020，110：18-28.
[77] WANG M，LU Y，BOTELLA J R，et al.Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system[J].Molecular Plant，2017，10（7）：1007-1010.
[78] MACOVEI A，SEVILLA N R，CANTOS C，et al.Novel alleles of rice eIF4G generated by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis confer resistance to Rice tungro spherical virus[J].Plant Biotechnology Journal，2018，16（11）：1918-1927.
[79] YANG X，ZHOU H，ZHOU X.Rock paper scissors：CRISPR/Cas9-mediated interference with geminiviruses in plants[J].Science China Siences，2019，62：1389-1391.
[80] JI X，ZHANG H，ZHANG Y，et al.Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants[J].Nature Plants，2015，1（10）：1-4.
[81] HUANG R，LI Y，TANG G，et al.Dynamic phytohormone profiling of rice upon rice black-streaked dwarf virus invasion[J].Journal of Plant Physiology，2018，228：92-100.
[82] YANG X，CHEN B，ZHANG T，et al.Geographic distribution and genetic diversity of rice stripe mosaic virus in southern China[J].Frontiers in Microbiology，2018，9：3068.
[83] VARANDA C M R，FLIX M DO R，CAMPOS M D，et al.Plant viruses：From targets to tools for CRISPR[J].Viruses，2021，13（1）：1-19.
[84] ZHANG T，ZHENG Q，YI X，et al.Establishing RNA virus resistance in plants by harnessing CRISPR immune system[J].Plant Biotechnology Journal，2018，16（8）：1415-1423.
[85] HONG W J，KIM Y J，KIM E J，et al.CAFRI-Rice：CRISPR applicable functional redundancy inspector to accelerate functional genomics in rice[J].The Plant Journal，2020，104（2）：532-545. [86] MAGALLANES L A M，SIMSEK S.Pathogens control on wheat and wheat flour：A review[J].Cereal Chemistry，2020，98（1）：17-30.
[87] HAWERROTH G，ARAUJO L，RODRIGUES F .Infection process of Gaeumannomyces graminis var.graminis on the roots and culms of rice[J].Journal of Phytopathology，2017，165（10）：692-700.
[88] TOSA Y，TADA S.Operation of resistance genes in wheat to Erysiphe graminis f.sp.tritici against E. graminis f.sp.agropyri[J].NRC Research Press Ottawa，Canada，1990，33（2）：231-234.
[89] WANG S，ZONG Y，Lin Q，et al.Precise，predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC-Cas9[J].Nature Biotechnology，2020，38（12）：1460-1465.
[90] ZHANG Y，PRIBIL M，PALMGREN M，et al.A CRISPR way for accelerating improvement of food crops[J].Nature Food，2020，1（4）：200-205.
[91] GAO C.Genome engineering for crop improvement and future agriculture[J].Cell，2021，184（6）：1621-1635.
[92] ZHU H，LI C，GAO C.Applications of CRISPR-Cas in agriculture and plant biotechnology[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2020，21（11）：661-677.
[93] CHEN K，WANG Y，ZHANG R，et al.CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture[J].Annual Review of Plant Biology，2019，70（1）：667-697.
[94] ZHANG Y，BAI Y，WU G，et al.Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat[J].The Plant Journal，2017，91（4）：714-724.
[95] CHOWDHURY J，SCHOBER M S，SHIRLEY N J，et al.Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene （HvGsl6） in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f.sp.Hordei[J].New Phytologist，2016，212（2）：434-443.
[96] LIU H，WANG K，JIA Z，et al.Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system[J].Journal of Experimental Botany，2020，71（4）：1337-1349.
[97] WANG Y，CHENG X，SHAN Q，et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J].Nature Biotechnology：The Science and Business of Biotechnology，2014，32（9）：947-951.
[98] ASIIMWE T，STEWART L R，WILLIE K，et al.Maize lethal necrosis viruses and other maize viruses in Rwanda[J].Plant Pathology，2020，69（3）：585-597.
[99] YADAVA P，ABHISHEK A，SINGH R，et al.Advances in maize transformation technologies and development of transgenic Maize[J].Frontiers in Plant Science，2017，7：1-12. [100] DAI D，MA Z，SONG R.Maize kernel development[J].Molecular Breeding，2021，41（1）：1-33.
[101] WANG Y，LIU X，ZHENG X，et al.Creation of aromatic maize by CRISPR/Cas[J].Journal of Integrative Plant Biology，2021，1-19.
[102] ZHANG Q，ZHANG Y，LU M H，et al.A novel ternary vector system united with morphogenic genes enhances CRISPR/Cas delivery in maize[J].Plant Physiology，2019，181（4）：1441-1448.
[103] KWEON J，KIM D E，JANG A H，et al.CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries[J].PLoS ONE，2018，13（6）：1-9.
[104] PERRY E D，CILIBERTO F，HENNESSY D A，et al.Genetically engineered crops and pesticide use in U.S.maize and soybeans[J].Science Advances，2016，2：1-8.
[105] BARONE P，WU E，LENDERTS B，et al.Efficient gene targeting in maize using inducible CRISPR-Cas9 and marker-free donor template[J].Molecular Plant，2020，13（8）：1219-1227.
[106] CHILCOAT D，LIU Z-B，SANDER J.Use of CRISPR/Cas9 for crop improvement in maize and soybean[J].Progress in Molecular Biology and Translational Science，2017，149：27-46.
[107] HANSJAKOB A，RIEDERER M，HILDEBRANDT U.Wax matters：absence of very-long-chain aldehydes from the leaf cuticular wax of the glossy11 mutant of maize compromises the prepenetration processes of Blumeria graminis[J].Plant Pathology，2011，60（6）：1151-1161.
[108] LIU Y，ZHU A，TAN H，et al.Engineering banana endosphere microbiome to improve Fusarium wilt resistance in banana[J].BioMed Central，2019，7（1）：1-15.
[109] CORDOBA L，SILVA R，GOMES D，et al.Brazilian green banana[J].Journal of Thermal Analysis and Calorimetry，2018，134（3）：2065-2973.
[110] TRIPATHI L，NTUI V O，TRIPATHI J N，et al.Application of CRISPR/Cas for diagnosis and management of viral diseases of banana [J].Frontiers in Microbiology，2021，11：1-13.
[111] TSANNI A.Top banana：developing varieties that resist disease[J].Nature，2020，587（7834）：514.
[112] KWEON J，KIM D E，JANG A H，et al.CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries[J].PLoS ONE，2018，13（6）：1-9.
[113] NAIM F，DUGDALE B，KLEIDON J，et al.Gene editing the phytoene desaturase alleles of Cavendish banana using CRISPR/Cas9[J].Transgenic Research，2018，27（5）：451-460.
[114] TRIPATHI J N，NTUI V O，RON M，et al.CRISPR/Cas9 editing of endogenous banana streak virus in the B genome of Musa spp.overcomes a major challenge in banana breeding[J].Communications Biology，2019，2（1）：1-11. [115] KAUR N，ALOK A，SHIVANI，et al.CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase （PDS） demonstrates precise manipulation in banana cv.Rasthali genome[J].Functional & Integrative Genomics，2018，18（1）：89-99.
[116] SHAO X，WU S，DOU T，et al.Using CRISPR/Cas9 genome editing system to create MaGA20ox2 gene-modified semi-dwarf banana[J].Plant Biotechnology Journal，2019，18（1）：17-19.
[117] MAXMEN A.CRISPR might be the banana’s only hope against a deadly fungus[J].Nature：International Weekly Journal of Science，2019，574（7776）：1-5.
[118] 胡春华，邓贵明，孙晓玄，等.香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立[J].中国农业科学，2017，50（7）：1294-1301.
[119] PEER R，RIVLIN G，GOLOBOVITCH S，et al.Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in perennial fruit trees[J].Planta，2015，241（4）：941-951.
[120] JIANG W Z，YANG B，WEEKS D P.Efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations[J].PLoS ONE，2017，9（6）：e99225.
[121] WU R，LUCKE M，JANG Y，et al.An efficient CRISPR vector toolbox for engineering large deletions in Arabidopsis thaliana[J].Plant Methods，2018，14（1）：65.
[122] ZHANG Z，MAO Y，HA S，et al.A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis[J].Plant Cell Reports，2016，35（7）：1519-1533.
[123] JIANG W，ZHOU H，BI H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].Nucleic Acids Research，2013，41（20）：e188.
[124] FENG Z，MAO Y，XU N，et al.Multigeneration analysis reveals the inheritance，specificity，and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2014，111（12）：4632-4637.
[125] MERKER L，SCHINDELE P，HUANG T-K，et al.Enhancing in planta gene targeting efficiencies in Arabidopsis using temperature-tolerant CRISPR/ LbCas12a[J].Plant Biotechnology，2020，18：2382-84.
[126] AMAN R，MAHAS A，BUTT H，et al.Engineering RNA virus interference via the CRISPR/Cas13 machinery in Arabidopsis[J].Viruses，2018，10（12）：1-9.
[127] 張思琦，何佳，贺凌霄，等.基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析[J].烟草科技，2020，53（5）：17-25.
[128] 姚恒，杨大海，白戈，等.利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1[J].生物技术通报，2018，34（11）：97-102.
[129] 姚恒，白戈，谢贺，等.利用CRISPR/Cas9技术创制烟草NtabMYC2基因的定点突变[J].分子植物育种，2017，15（6）：2328-2334.
[130] GAO J，WANG G，MA S，et al.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J].Plant Molecular Biology，2015，87：99-110. [131] RUYI R，QIANG Z，FUTAI N，et al.Breeding for PVY resistance in tobacco LJ911 using CRISPR/Cas9 technology[J].Crop Breeding and Applied Biotechnology，2021，21（1）：1-6.
[132] ZHANG T，ZHAO Y，YE J，et al.Establishing CRISPR/Cas13a immune system conferring RNA virus resistance in both dicot and monocot plants[J].Plant Biotechnology Journal，2019，17（7）：1185-1187.
[133] 馮吉，程玲，蔡长春.基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究[J/OL].中国烟草科学，2021，1-8.
[134] 刘翠花.烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究[D].重庆：西南大学，2020.
[135] DENG L，WANG H，SUN C，et al.Efficient generation of pink-fruited tomatoes using CRISPR/Cas9 system[J].Journal of Genetics and Genomics，2018，45（1）：51-54.
[136] BROOKS C，NEKRASOV V，LIPPMAN Z B，et al.Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 system[J].Plant Physiology，2014，166（3）：1292-1297.
[137] THOMAZELLA D，BRAIL Q，DAHLBECK D，et al.CRISPR-Cas9 mediated mutagenesis of a DMR6 ortholog in tomato confers broad-spectrum disease resistance[J].Biorxiv，2016，1-23.
[138] SHARMA S，BHATTARAI K.Progress in developing bacterial spot resistance in tomato[J].Agronomy，2019，9（1）：1-11.
[139] KIEU N P，LENMAN M，WANG E S，et al.Mutations introduced in susceptibility genes through CRISPR/Cas9 genome editing confer increased late blight resistance in potatoes[J].Scientific Reports，2021，11：1-12.
[140] JOHANSEN I E，LIU Y，JRGENSEN B，et al.High efficacy full allelic CRISPR/Cas9 gene editing in tetraploid potato[J].Scientific Reports，2019，9（1）：1-7.
[141] LI T，YANG X，YU Y，et al.Domestication of wild tomato is accelerated by genome editing[J].Nature biotechnology：The Science and Business of Biotechnology，2018，36（12）：1160-1163.
[142] WANG T，ZHANG H，ZHU H.CRISPR technology is revolutionizing the improvement of tomato and other fruit crops[J].Horticulture Research，2019，6（1）：1-13.
[143] 谢胜松，张懿，张利生，等.CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J].遗传，2015，37（11）：1125-1136.
[144] 郑武，谷峰.CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J].遗传，2015，37（10）：1003-1010.
[145] ZUO E，SUN Y，WEI W，et al.Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos[J].Science （New York，N.Y.），2019，364（6437）：289-292.
[146] MAHER M F，NASTI R A，VOLLBRECHT M，et al.Plant gene editing through de novo induction of meristems[J].Nature Biotechnology.2020，38（1）：84-89. [147] LEI Y，LU L，LIU HY，et al.CRISPR-P：A web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-System in plants[J].Molecular Plant，2014，7（9）.
[148] 朱晓菲，黄娇媚，原昊，等.Class2 CRISPR-Cas系统发掘及分析方法[J].热带生物学报，2021，12（1）：115-123.
[149] 曹林艳，王青豪，唐林，等.双歧杆菌中CRISPR-Cas系统生物信息学分析[J].中国微生态学杂志，2020，32（11）：1241-1247.
[150] ALKHNBASHI O S，MEIER T，MITROFANOV A，et al.CRISPR-Cas bioinformatics[J].Methods，2020，172：3-11.
[151] GAO C.The future of CRISPR technologies in agriculture[J].Nature Reviews.Molecular Cell Biology，2018，19（5）：275-276.
[152] 张昆，陈景超，李祎，等.CRISPR/Cas9技术在微生物研究中的应用进展[J].微生物學通报，2018，45（2）：451-464.
[153] AHMAD S，WEI X，SHENG Z，et al.CRISPR/Cas9 for development of disease resistance in plants：recent progress，limitations and future prospects[J].Briefings in Functional Genomics，2020，19（1）：26-39.
[154] 任明见.小麦优质亚基和抗白粉病基因聚合体的标记辅助选择研究[J].山地农业生物学报，2009，28（4）：283-287.
[155] 肖仲久，佀胜利，李小霞，等.小麦主要病害的抗病基因研究进展[J].山地农业生物学报，2007（2）：171-178.
关键词：CRISPR技术;抗病性;基因编辑
中图分类号：S332.2
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）04-0046-12
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.007
Abstract：With the rapid development of genome editing technology，it has become one of the important means of plant disease resistance breeding.In recent years，CRISPR technology has been widely used in plant disease resistance gene improvement due to its advantages of simple design and operation，high success rate，strong versatility，low cost，and no pollution of exogenous genes after genetic editing.CRISPR consists of several discontinuous direct repeat sequences，which have the function of removing invading viruses and foreign DNA and protecting itself from infection.This paper reviewed the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance genes of monocotyledons （rice，wheat，maize，banana） and dicotyledons （Arabidopsis thaliana，tobacco，tomato），discussed its advantages and disadvantages，and prospected its application prospect，so as to promote the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance of plants.
Keywords：CRISPR technology; disease resistance;gene editing
全球的粮食问题一直以来都是被广泛关注的焦点，尽管造成粮食产量损失的因素很多，但作物病害的普遍发生却一直都是限制其生产的主要因素之一[1-2]。作物易受各种真菌、细菌和病毒的侵染，而造成巨大的产量损失[3]。随着科学研究的不断深入，增强作物抗病性已被证实是病害防治的重要方法之一[4-5]。近年来基因组编辑技术发展迅速，已成为增强植物抗病性的重要手段之一[2，4，6]。基因组编辑技术依靠基因工程核酸酶切割特定的DNA序列来产生特定位点的双链断裂（double strand breaks，DSBs），使DNA通过非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）被修复，这一过程常常导致碱基替换、插入和缺失以及相关基因的突变。其方法主要包括利用巨核酸酶、锌指核糖核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）进行定点修饰[3，5，7-8]。
不同于ZFN和TALEN技术操作的复杂性及耗时性，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术只需要改变20 bp的gRNA便可靶向不同的基因[6，9]。除了用于动物中的抗病毒研究，近年来，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术同样也被应用于植物的抗病育种中[7，10]。由于CRISPR/Cas9系统具有设计和操作简单、成功率高、通用性强、成本低、遗传编辑之后不留有外源基因污染等优点[1，4，7，9]。此外，研究发现利用CRISPR/Cas9技术诱导产生DSB（双链断裂）和双生病毒（植物病毒家族，具有单链环状DNA基因组，宿主范围广泛，可作为HDR过程中的修复模板）载体，可获得足量供体DNA导入细胞，提高靶向KI（基因敲入）效率[11-13]。上述研究使CRISPR/Cas9基因组编辑技术的使用率在很大程度上已经超过其他基因组编辑技术，成为科学家所掌握的对基因组进行精确编辑的最有效的工具[4，14]。2020年10月7日，瑞典皇家科学院将2020年诺贝尔化学奖授予Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，以表彰她們发现CRISPR / Cas9基因剪刀，在基因组编辑领域做出了巨大的贡献。CRISPR于1987年在大肠杆菌中被首先发现，之后研究人员接连在各种细菌和古细菌的基因组中观察到了相似的结构，于2002年正式提出了CRISPR的概念[3，15-17]。CRISPR具有为自身提供特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件入侵的功能[2，4，18]，还会与Cas蛋白结合形成CRISPR/Cas系统，能对目标基因进行准确的直接修饰[19]。本文将从CRISPR技术在植物抗病基因改良中的应用入手，讨论其优缺点，并展望CRISPR在植物抗病基因改良中的应用前景。 1 CRISPR及组成
CRISPR由两部分组成，即CRISPR基因座和由Cas蛋白家族编码的基因[20-21]。其中CRISPR基因座由前导序列 （Leader Sequence）、CrRNA （CRISPR RNA）和一系列高度保守的重复序列（Repeat）与随机的间隔序列 （Spacer）交替排列组成（图1）[7，22-23]。Cas系列蛋白编码基因以操纵子的形式排列，具有间隔区获得、CrRNA加工、靶点切割和其他辅助作用 [24-27]。CRISPR/Cas系统主要通过获得性免疫，抵抗病毒和外源 DNA的入侵 [22，25]。由于Cas基因的核心元件序列各不相同，CRISPR/Cas系统可以分为三种不同的类型（I型、II型和III型）[26，28]。但这三种不同类型的系统都包含两个通用基因：Cas1（不具有序列特异性的金属依赖性DNA酶，可能参与外源DNA的侵入过程）和Cas2（金属依赖性内核糖核酸酶，可能参与间隔区的获得過程）[20，27，29]，且各具有一个独特的特征基因，分别为Cas3（可编码具有独立的解旋酶和DNA酶活性的大蛋白和可能形成具有不同组成的级联状复合物的蛋白质的基因）、Cas9（含有RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域的大蛋白）和Cas10（含有与核酸聚合酶和核苷酸环化酶结构域同源的结构域的蛋白） [30-35]。因此，这三种系统的功能及操作方式具有相似性但又有所不同，例如三种系统的功能都主要依赖于crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA （Trans-activating chimeric RNA） 结合形成的双元复合体引导Cas（CRISPR-associated system） 蛋白对外源 DNA 进行序列特异性降解[36-40]，但在对DNA双链进行切割时，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体才能操作，而Ⅱ型则只需要1个Cas9蛋白即可完成[28，39]。
不同于传统植物基因编辑技术，植物CRISPR/Cas9系统可以通过一个双元载体的T-DNA构建多个sgRNA 表达盒，并使每种sgDNA携带不同的靶序列或利用前体tRNA剪切产生多种sgDNA[41-45]，实现同时对多个基因位点的编辑，大大提高了基因编辑的效率。因而，CRISPR/Cas9系统比其他两种系统使用的更广泛。如今CRISPR/Cas9系统已被应用到拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组编辑的研究中 [20，25，29，35，40]，已成为现今公认的增强作物抗病性的重要手段之一（图1）。而由CRISPR/Cas9系统衍生的一系列基因编辑技术，如利用CRISPR/Cas系统构建RGNs系统（由RNA引导核酸酶（RGNs）在特定的位置使DNA双链断裂（DBS））修复序列的方法也已被广泛用于靶向基因组的编辑中[46-48]。
2 CRISPR技术在单子叶植物抗病中的应用
2.1 CRISPR技术在水稻抗病中的应用
2.1.1 CRISPR技术在防治水稻真菌病害中的应用——以水稻稻瘟病为例
水稻（Oryza sativa L.）为世界三大粮食作物之一，为单子叶模式植物[49]，如其他许多作物一般易受自然界各种病原物的侵染，而导致每年产量损失巨大，因而对其进行分子生物学研究意义重大[50，57]。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的一种破坏性极强的真菌病害，是水稻三大病害之一[49，58]。稻瘟病可以发生在水稻生长的任何时期，在我国已多次发生[51，59]。经过多年的研究，抗性育种已被证实是防治该病害最有效的方法。由于稻梨孢具有小种变异快的特点，导致稻瘟病抗性品种在3～5年的田间种植之后就会丧失抗性[52-54]。在传统的水稻抗病育种中，诱变育种和杂交育种是主要的育种方法[33]。通过人工选择和抗性鉴定，将抗稻瘟病品种的抗性基因导入水稻植株，从而培育出抗稻瘟病新品种[55]。该方法周期长、成功率低，已无法有效控制稻瘟病的发生[56]。
目前，CRISPR/Cas9 基因编辑技术已在编辑水稻Pita、Pi21、Pi20、ERF922和bsr-d1等稻瘟病抗性相关基因方面得到应用[51，60，62，66]。经PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）鉴定及效率分析和对突变体稻瘟病的抗性鉴定发现，靶位点存在多种突变类型，且突变率较高，突变体的抗性明显高于野生型，即证明利用CRISPR/Cas9技术进行抗稻瘟病育种的方法可行[49，53，61]。此外，随着序列特异性核酸酶（Sequence specific nuclease，SSNs）的发现和应用，CRISPR/Cas9已被证实是最有效的SSNs[62-63]。以CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）为主的水稻抗稻瘟病的工程已成功改良水稻OsERF922基因（抗稻瘟病负调控因子），大大增强了水稻对稻瘟病的抗性[53，64-66]，为培育水稻抗稻瘟病新品种带来了新的机遇。
2.1.2 CRISPR技术在防治水稻细菌病害中的应用——以水稻白叶枯病为例
水稻黄单胞菌水稻致病变种Xoo（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）是水稻白叶枯病的致病菌[67]。水稻白叶枯病是危害世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一[68]。Xoo 主要通过水稻叶片上的伤口或水孔侵入水稻维管束生长和大量增殖，阻塞维管束，从而导致水稻死亡[60，71]。已有研究证明，利用CRISPR/Cas9系统可敲除水稻Os8N3或SWEET13基因，增强水稻对Xoo的抗性[69-70]。利用CRISPR技术过对水稻OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWET14三个敏感基因进行靶向编辑，已成功获得具有广谱抗白叶枯病性的水稻新品种[72-74]。而利用Cas9/sgRNA构建水稻原生质体细胞，以Xoo易感性基因OsSWEET14和OsWEET11启动子区为靶点，即可培育对白叶枯病有抗性的水稻新品种[54，73，75]。 2.1.3 CRISPR技术在防治水稻病毒病中的应用
植物病毒可引发多种病害，其对农业生产造成巨大损失[76]。CRISPR来源于细菌和古生菌的基因组，其最初的功能是为细菌提供抗外源病毒的特异性免疫保护机制，因此也可用于植物抗病毒性的研究[3，6，11，17]。根据植物病毒需要在宿主细胞中进行繁殖的特性[77]，研究人员利用CRISPR技术在病毒侵染的关键时期对宿主细胞进行定向编码，即可获得抗病毒植株[4，36，38]。例如，借助CRISPR/Cas9技术定向编码产生的水稻eIF4G基因对水稻东格鲁球形病毒（与水稻东格鲁杆状病毒共同作用引起水稻东格鲁球形病毒病）具有抗性[78-80]，可用于水稻抗东格鲁球形病毒病（热带亚洲水稻生产的一个严重制约因素）育种[79]。此外，研究发现通过CRISPR技术分别靶向南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）双链RNA基因组的crRNA（CRISPR-derived RNA）和水稻条纹花叶病毒（RSMV）单链RNA基因组的crRNA，构建的转基因水稻植株分别对SRBSDV和RSMV有很好的抗性，即证明特异性靶向病毒基因组的crRNA-LshCas13a，使其过度表达是一种有效的抗RNA病毒的途径[80-85]。
2.2 CRISPR技术在小麦抗病基因改良中的应用——以小麦白粉病为例
小麦是世界三大谷物之一，在世界各地广泛种植[86]。小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis）引起的，其主要危害小麦叶片，而使小麦产量受损[154-155]。虽早有研究报道抗性育种为防治该病害最重要的方法之一[87-88]。但由于小麦关键基因的拷贝较多，致使育种过程需要的时间过长[89-90]。所以在使用传统育种方法已成功培育出抗性水稻品种时，小麦的抗性育种却一直没有进展。而如今得益于基因编辑技术的发展，研究发现利用CRISPR/Cas9技术对小麦某些负调控基因（如：RESISTANCE1（EDR1））进行编辑[91-93]，使这些基因控制的性状在不同程度上得到改良，即可获得抗病、抗逆性品种[94]。此外，研究发现了3个TaMLO同源基因的突变可使小麦对白粉病产生广谱抗性[95-96]，高彩霞课题组已于2014年利用CRISPR基因编辑技术成功修改了六倍体小麦的DNA，培育出抗白粉病小麦品种（Taedr1）[94，97]。
2.3 CRISPR技术在玉米抗病基因改良中的应用——以双生病毒病为例
玉米（Zea mays L.）是优良的粮食作物，被广泛种植于热带和温带地区，具有极好的环境适应性[98]。由于与传统的粮食作物小麦、水稻等相比玉米的种植环境大都比较恶劣，所以对玉米基因组的研究虽早已开展，但都主要集中于抗逆品种的培育及对其农艺性状的改良方面[99-100]。例如，利用CRISPR/Cas9 技术编辑ARGOS8（乙烯负调控因子）基因使其过量表达，可成功培育出抗旱高产的玉米[101]。而CRISPR技术在玉米抗病基因改良中的应用，目前则主要集在于利用CRISPR/Cas9系统培育抗双生病毒病（常发生于热带和亚热带地区，可使玉米植株畸形，穗部细小，对其产量造成严重影响）品种的研究中[102-104]，如培育玉米条斑病的抗性育种，现已发现Cas9蛋白和sgRNAs的过度表达可抑制双生病毒基因组的复制，为玉米抗性育种的开展提供了基础[105-107]。
2.4 CRISPR技术在香蕉抗病基因改良中的应用——以病毒病为例
作为重要的经济作物之一，香蕉（Musa nana Lour.）的生产常受香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV）的影响[108]。該病毒可将自身的基因组整合到宿主的基因组中形成内源BSV（eBSV），在胁迫条件下eBSV会活化对植物体进行感染[109]。香蕉全基因组序列的已知加上再生和遗传转化体系的建立，使基因编辑技术在香蕉上得到广泛应用[110]。但由于在香蕉主栽品种中存在整合的eBSV，使得香蕉种质资源的保存和杂交育种的进行依旧充满挑战[109，111]。据报道肯尼亚科学家团队利用CRISPR/Cas9技术定向编辑eBSV，使其失活，已成功阻止感染性病毒颗粒[112]。相信随着研究的深入，将来即可通过CRISPR/Cas9的靶向基因编辑永久地灭活内源性eBSV，成功培育出抗条斑病毒的香蕉品种[113]。
此外，研究发现利用CRISPR/Cas9技术编辑香蕉eIF基因家族可获得对香蕉束顶病毒属（Babuvirus）的抗性[114];还可激活香蕉的内源性防御基因，如抗病基因、致病相关基因、受体激酶和抗菌蛋白等[108，115]。如今，通过对抗病野生香蕉和感病香蕉转录组学的研究，已成功找到了香蕉抗细菌病的靶基因[116]。使用CRISPR技术敲除单个或多个易感基因（如MLO13、DMR6）、转运蛋白基因（如SWEET14）和负性调节因子（如E3泛素连接酶）可使香蕉对香蕉细菌性枯萎病菌产生抗性[117-119]。
3 CRISPR技术在双子叶植物抗病中的应用
3.1 CRISPR技术在拟南芥抗病基因改良中的应用
拟南芥为双子叶模式植物，素有“植物中的果蝇”之称，是进行遗传学研究的好材料[7]。研究人员在利用CRISPR/Cas9系统对拟南芥进行基因编辑时发现：通过对叶片组织进行的绿色荧光信号标记，成功在后代中检测到被修饰基因的遗传，且在F2代中仍有50%修饰[120-121]，证实由CRISPR/Cas9系统编辑的基因具有可稳定遗传的特性，可用于抗性品种的培育。加之发现拟南芥受病原物侵染时DMR6突变体（与水杨酸（SA）稳态相关基因缺失形成）的数量会增加，并与DLO1基因（DMR6同源基因）协同合作，积累SA（SA水平的提高是产生抗性的基础）激活植物的免疫功能，而使拟南芥产生抗性[72，122-124]。且在双子叶植物番茄、马铃薯等中都观察到了类似可产生抗性的基因，使CRISPR技术得以在双子叶植物抗病中得以广泛应用[12]。 近年发现的利用CRISPR/Cas13（Cas13酶，能特异性编辑RNA但不改变基因组）技术在拟南芥中构建抗RNA病毒的CRISPR/Cas系统的方法，已成功应用于原核生物中抵御RNA和DNA病毒[126]。而使用CRISPR/LshCas13a系统构建转基因拟南芥植株，以干扰芜菁花叶病毒（TuMV）RNA基因组实验的成功[80，83，85]。证实利用CRISPR / Cas13系统抗病毒策略的可行性，为双子叶植物病毒病的防治提供了又一方案。
3.2 CRISPR技术在烟草抗病基因改良中的应用
烟草是世界范围内重要的经济作物之一，因其品质极易受化学农药及其他物理因素（温度、水分等）的影响，烟草的抗病育种研究显得尤为重要[127-128]。目前，通过ZFN和TALENs，已成功靶向中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）、烟草卷曲茎病毒 （tobacco curly shoot virus，TbCSV）、烟草曲茎病毒（TbCSV）和云南番茄曲叶病毒（tomato leaf curl Yunnan virus，TLCYnV）基因，赋予了转基因烟草对这四种病毒的部分抗性[76-77]。此外，研究发现通过CRISPR/Cas9系统定向编辑双生病毒基因组，可提高烟草对双生病毒的抗性[129];CRISPR/FnCas9系统可有效抑制黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒在植物中的复制;C2c2（一种靶向RNA的新型CRISPR系统）可以切割单链RNA[130]，干扰芜菁花叶病毒在植物中的复制;利用CRISPR/Cas9技术敲除Va基因（单隐性基因，决定烟草对马铃薯Y病毒（PVY）的易感性），可培育抗PVY烟草植株[131]。研究人员利用来自新凶手弗朗西丝菌（Francisella novicida）的CRISPR/Cas9系统和沙氏纤毛菌（Leptotrichia shahii）的 CRISPR/Cas13a 系统，成功赋予了烟草对RNA病毒的抗性，实现了广谱抗病毒的目标[132]。
由青枯雷尔氏杆菌（Ralstonia solanacearum （E.F.Smith） Yabuuchi et al.）引起的烟草青枯病，是对世界烟草产业具有重要影响的细菌性病害[133]。目前，已有研究证实烟草VQ基因家族（植株中广泛存在的一类调节因子）与烟草对青枯病的抗性有关，利用CRISPR/Cas9技术编辑获得的NtVQ35基因的植株对青枯病菌有负向调控作用[134]，且不会影响植株正常的生长和表型变化，可用于烟草抗青枯病育种。
3.3 CRISPR技术在番茄抗病基因改良中的应用
番茄（Solanum lycopersicum）为茄科植物，是世界上最重要的农作物之一，也是世界上第二大消费蔬菜[135]，具有重要的经济价值，因长期受植物病原菌（如丁香假单胞菌、黄单胞属菌和疫霉属菌物）的影响而损失巨大[136]。基于对其基因组研究工作的进行，目前已成功在番茄基因组中鉴定出一个DMR6的同源基因（SlDMR6-1）[72]，利用CRISPR/Cas9系统构建番茄SlDMR6-1基因缺失植株结果显示：该基因对多种植物源菌物具有活性，且对植物的生长发育无明显影响，即证明可利用该技术进行抗病性番茄的培育[137]。目前，利用CRISPR/Cas9技术对番茄中的广谱抗白粉病mlo隐性突变基因的研究[138]及抗番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的植株的培育工作正在顺利进行中[81]。
此外，在利用CRISPR技术对大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）的研究取得成功后，已开始在番茄和马铃薯晚疫病（一种毁灭性的病害）病原菌致病疫霉（P.infestans）中建立CRISPR/Cas9系统[139]。并成功在四倍体马铃薯中鉴定出提高马铃薯晚疫病抗性的基因（StDMR6-1和StCHL1），使马铃薯的抗性育种得以突破[140]。
4 CRISPR技术在应用过程中存在的问题
如今，CRISPR/Cas9 系统的应用十分广阔[76]，已成为实现提高作物的产量、持续抗性及优良品质等育种目标的重要工具[43，56，75]。尽管如此，现阶段CRISPR技术在应用过程中仍存在很多问题，主要包括：（1）还有许多植物由于有效遗传转化体系难以建立而无法开展大规模 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的研究[13，25];（2）虽然对许多植物，特别是农作物的全基因组测序工作現在已经完成。然而，决定许多重要性状的主效基因仍尚未发现或得到鉴定，这限制了 CRISPR/Cas9 技术在植物基因工程育种中的应用[39，42，141];（3）CRISPR系统对PAM序列的要求严格导致可以编辑的序列数较低、来源不同的Cas9基因和不同的靶位点导致突变效率不同[59，62，142]、植物中同源重组（homologous recombination，HR）的效率很低、这些因素都在一定程度上限制基因组的编辑效率[123];（4）存在脱靶现象，靶位点专一性有待提高[143-144];（5）目前的研究主要集中在利用CRISPR/ Cas9 技术破坏靶基因的功能上。而对如何利用 HDR（homology-directed repair，同源定向修复） 在基因组靶位点引入相关功能基因的研究较少，使得一些应用的预期受到阻碍，如基因替换和大规模染色体缺失的基因工程[78-79];（6）突变植株在自然环境条件下的表现仍具有不确定性，不能直接在自然环境中获得经过基因组编辑的植物;（7）由于在使用CRISPR/Cas9技术编辑作物基因组时仍需要借助转基因的技术手段，且突变植株在自然环境条件下的表现仍具有不确定性，而对该技术是否属于转基因范畴以及是否应该按照转基因的管理办法来进行监管仍具有争议[14，16]。 5 展望
從目前的研究来看，CRISPR/Cas9技术的应用较其他基因编辑技术更广泛主要得益于：（1）靶位点具有广泛性：CRISPR/Cas9编辑技术所需的具有NGG的PAM序列的靶位点，在基因组中广泛存在，因此CRISPR/Cas9系统的应用广泛[60，70，151];（2）靶位点特异性高：在单子叶模式植物——水稻中的脱靶率低，在双子叶模式作物——拟南芥和烟草中没有发现脱靶现象[78，144];（3）载体组装过程简便;（4）遗传编辑之后不会造成外源基因污染现象，提高了人们对“烟草”等因为国际贸易限制而不允许转基因作物的接受程度[54，57，150];（5）由于双元载体T-DNA结构的存在，可实现同时对多个基因位点的编辑;（6）由CRISPR介导的植物抗病基因改良在某些情况下对多种病原体具有广谱抗性[37，152];（7）通过CRISPR系统作用产生抗性的植物不仅仅局限于试验研究及温室，一些CRISPR作物品种已开始商业化，如：含强化欧米伽-3油的亚麻荠（Camelina sativa （L.） Crantz）已进入美国市场[2，67，149];（8）CRISPR/Cas9技术在基因表达调控，表观遗传学、基因座定位和染色体结构研究及基因功能筛选等方面的研究中也可发挥重要作用。
此外，该技术在其他（植物技术方面也显示出良好的应用前景。例如，采用新生分生组织编辑双子叶植物的基因可省略耗时的组织培养步骤[146];使用耐温CRISPR/LbCas12a可以提高靶向性和突变效率，实现在水稻基因组中精确插入DNA序列[81];应用热诱导CRISPR系统可以提高玉米基因识别靶标的效率[82];由Cas9蛋白的两个切割结构域发生突变与sgRNA形成复合物，具有RNA干扰的作用[8]等。当然，目前关于CRISPR/Cas9系统仍有许多亟待解决的问题，为使其得到更好的应用，研究者已开始着手进行解决。例如，CRISPR技术在基因编辑方面存在的脱靶和靶位点专一性较低的问题[147]。目前已经有专业的软件，如Cas-OFFinder、SureDesign（由安捷伦公司开发）等，用于寻找 CRISPR/Cas9靶位点、设计sgRNA[148]。还可根据各种影响因素对突变频率的影响，提示软件用户避开可能脱靶的位点、选择突变效率较高的位点[149，153]。由病毒诱导的 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统的开发，使CRISPR/Cas9系统的脱靶率大幅度较低。作为一种新的基因组编辑技术，CRISPR-Cas9系统正在面对着全球粮食生产的危机，目前大量粮食作物的高产、优质、抗逆性育种发展已进入瓶颈期，是机遇也是巨大的挑战。随着越来越多的研究人员和实验室的加入，CRISPR/Cas9 技术将在这个充满各种挑战和诱惑的后基因组时代变得更加有用，在未来得到更广泛的应用。
参 考 文 献：
[1] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product.[J].Journal of Bacteriology，1987，169（12）：5429-33.
[2] TIAN J，XU G，YUAN M.Towards Engineering broad-spectrum disease-resistant crops[J].Trends in Plant Science，2020，25（5）：424-427.
[3] LI S，SHEN L，HU P，et al.Developing disease-resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene editing[J].Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（12）：1201-1205.
[4] PIXLEY K V，FALCK-ZEPEDA J B，GILLER K E，et al.Genome editing，gene drives，and synthetic biology：will they contribute to disease-resistant crops，and who will benefit？[J].Annual Review of Phytopathology，2019，57：165-188
[5] BIKAL G.Use of Crispr/Cas9 for development of disease resistant cultivars in plant breeding[J].International Journal of Applied Sciences and Biotechnology，2017，5（4）：403-409.
[6] KHLESTKINA E K，SHUMNY V K.Prospects for application of breakthrough technologies in breeding：The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing[J].Russian Journal of Genetics，2016，52（7）：676-687.
[7] HORVATH P，BARRANGOU R.CRISPR/Cas，the immune system of bacteria and archaea[J].Science，2010，327（5962）：167-170. [8] 林萌萌，李春娟，闫彩霞，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用[J].核农学报，2021，35（6）：1329-1339.
[9] HAFT D H，SELENGUT J，MONGODIN E F，NELSON K E.A guild of 45 CRISPR-associated （Cas） protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J].Plos Computational Biology，2005，1（6）：474-483.
[10] 姚祝平，程远，万红建，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用[J].分子植物育种，2017，15（7）：2647-2655.
[11] 曾秀英，侯学文.CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用[J].植物生理学报，2015，51（9）：1351-1358.
[12] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.
[13] PYZOCHA N K，CHEN S.Diverse class 2 CRISPR-Cas effector proteins for genome engineering applications[J].ACS Chemical Biology，2018，13（2）：347-56.
[14] 单奇伟，高彩霞.植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J].遗传，2015，37（10）：953-973.
[15] 汪莲，王浩君，罗云孜.CRISPR技术在微生物合成生物学中的应用[J].生命科学，2019，31（5）：493-507.
[16] KOONIN E V，MAKAROVA K S，ZHANG F.Diversity，classification and evolution of CRISPR-Cas systems[J].Current Opinion in Microbiology，2017，37：67-78.
[17] SHMAKOV S A，SITNIK V，MAKAROVA K S，et al.The CRISPR spacer space ss dominated by sequences from species-specific mobilomes[J].mBio，2017，8（5）：1-18.
[18] MAKAROVA K S，ARAVIND L，WOLF Y I，et al.Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems[J].Biology Direct，2011，6（1）：1-27.
[19] MAKAROVA K S，HAFT D H，BARRANGOU R，et al.Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J].Nature reviews microbiology，2011，9（6）：467-477.
[20] 景潤春，卢洪.CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J].中国农业科学，2016，49（7）：1219-1229.
[21] 刘耀光，李构思，张雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J].华南农业大学学报，2019，40（5）：38-49.
[22] 解莉楠，宋凤艳，张旸.CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J].中国农业科学，2015，48（9）：1669-1677.
[23] BOYD L A，RIDOUT C，O’SULLIVAN D M，et al.Plant-pathogen interactions：disease resistance in modern agriculture[J].Trends in Genetics，2013，29（4）：233-240.
[24] BORRELLI V M G，BRAMBILLA V，ROGOWSKY P，et al.The enhancement of plant disease resistance using CRISPR/Cas9 technology[J].Frontiers in Plant Science，2018，9：1245.
[25] BOONTAWON T，NAKAZAWA T，INOUE C，et al.Efficient genome editing with CRISPR/Cas9 in Pleurotus ostreatus[J].AMB Express，2021，11（1）：1-11.
[26] ZHANG Y，SHOWALTER A M.CRISPR/Cas9 genome editing technology：A valuable tool for understanding plant cell wall biosynthesis and function[J].Frontiers in Plant Science，2020，11：1-14. [27] BARMAN A，DEB B，CHAKRABORTY S.A glance at genome editing with CRISPR-Cas9 technology[J].Current Genetics：Microorganisms and Organelles，2020，66（12）：447-462.
[28] 马兴亮，刘耀光.植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J].遗传，2016，38（2）：118-125.
[29] 刘婷婷，范迪，冉玲玉，等.应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因[J].遗传，2015，37（10）：1044-1052.
[30] VEILLET F，DURAND M，KROJ T，et al.Precision breeding made real with CRISPR：Illustration through genetic resistance to pathogens[J].Plant Communications，2020，1（5）：100102.
[31] DAS A，SHARMA N，PRASAD M.CRISPR/Cas9：A novel weapon in the arsenal to combat plant diseases[J].Frontiers in Plant Science，2019，9：2008.
[32] ZAIDI S S，MUKHTAR M S，MANSOOR S.Genome editing：Targeting susceptibility genes for plant disease resistance[J].Trends in Biotechnology，2018，36（9）：898-906.
[33] 常振仪，严维，刘东风，等.CRISPR/Cas技术研究进展[J].农业生物技术学报，2015，23（9）：1196-1206.
[34] LANGNER T，KAMOUN S，BELHAJ K.CRISPR Crops：Plant genome editing toward disease resistance[J].Annual Review of Phytopathology，2018，56：479-512.
[35] TYAGI S，KUMAR R，KUMAR V，et al.Engineering disease resistant plants through CRISPR-Cas9 technology[J].GM Crops & Food，2021，12（1），125-144.
[36] ZAIDI S S，MAHAS A，VANDERSCHUREN H，et al.Engineering crops of the future：CRISPR approaches to develop climate-resilient and disease-resistant plants[J].Genome Biology，2020，21（1）：289.
[37] 平文丽，李雪君，林娟，等.CRISPR/Cas9介导的基因組编辑技术及其在作物品种改良中的应用[J].中国农学通报，2016，32（5）：16-22.
[38] 冷春旭，闫平，吴立成，等.CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用[J/OL].分子植物育种，2021，1-13.
[39] JIN S，ZONG Y，GAO Q，et al.Cytosine，but not adenine，base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J].Science，2019，364（6437）：292-295.
[40] 顾爽，郑文静，马殿荣.CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻育种应用的研究进展[J/OL].分子植物育种，2020，1-11.
[41] WANG M，MAO Y，LU Y，et al.Multiplex gene editing in rice with simplified CRISPR-Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems[J].Journal of Integrative Plant Biology，2018，60（8）：626-631.
[42] ZHOU J，DENG K，CHENG Y，et al.CRISPR-Cas9 based genome editing reveals new insights into MicroRNA function and regulation in rice[J].Frontiers in Plant Science，2017，8：8：1598.
[43] ZAYNAB M，SHARIF Y，FATIMA M，et al.CRISPR/Cas9 to generate plant immunity against pathogen[J].Microbial Pathogenesis，2020，141：103396.
[49] 徐鹏，王宏，涂燃冉，等.利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性[J].中国水稻科学，2019，33（4）：313-322.
[50] 唐秀英，王会民，龙起樟，等.CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用[J].分子植物育种，2017，15（3）：895-902. [51] 李伟滔，朱紫薇，尹俊杰，等.水稻“抗癌”新因子bsr-d1[J].自然杂志，2018，40（2）：131-135.
[52] 王加峰，郑才敏，刘维，等.基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建[J].作物学报，2016，42（8）：1160-1167.
[53] WANG F，WANG C，LIU P，et al.Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J].PLoS ONE，2016，11（4）：1-18.
[54] LIU M，SHI Z，ZHANG X，et al.Author correction：inducible overexpression of ideal plant architecture1 improves both yield and disease resistance in rice[J].Nature Plants，2019，5（8）：389-400.
[55] ASHKANI S，RAFII M Y，SHABANIMOFRAD M，et al.Molecular breeding strategy and challenges towards improvement of blast disease resistance in rice crop[J].Frontiers in Plant Science，2015，6（866）：1-14.
[56] SINGH P K，NAG A，ARYA P，et al.Prospects of understanding the molecular biology of disease resistance in rice[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（4）：1-39.
[57] FOSTER A J，MARTIN-URDIROZ M，YAN X，et al.CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein-mediated co-editing and counterselection in the rice blast fungus[J].Scientific Reports，2018，8（1）：1-12 .
[58] YAMATO T，HANDA A，ARAZOE T，et al.Single crossover-mediated targeted nucleotide substitution and knock-in strategies with CRISPR/Cas9 system in the rice blast fungus[J].Scientific Reports，2019，9（11）：1-8.
[59] ARAZOE T，MIYOSHI K，YAMATO T，et al.Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus[J].Biotechnology and Bioengineering，2015，112（12）：2543-2549.
[60] MA X，ZHANG Q，ZHU Q，et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J].Molecular Plant，2015，8（8）：1274-1284.
[62] 卿冬進，邓国富，戴高兴，等.利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体[J].分子植物育种，2020，18（16）：5343-5350.
[63] HU X，CUI Y，DONG G，et al.Using CRISPR-Cas9 to generate semi-dwarf rice lines in elite landraces[J].Scientific Reports，2019，9（1）：1-7.
[64] FIAZ S，AHMAD S，NOOR M A，et al.Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement：Perspectives and Opportunities[J].International Journal of Molecular Sciences，2019，20（4）：1-18.
[65] LU Y，TIAN Y，SHEN R，et al.Targeted，efficient sequence insertion and replacement in rice[J].Nature Biotechnology，2020，38：1402-1407.
[66] 吴凡，王月，陈闽，等.基于CRISPR/Cas9技术的水稻抗稻瘟病基因Pita突变体的创制[J].植物资源与环境学报，2020，29（2）：1-7.
[67] LI C，LI W，ZHOU Z，et al.A new rice breeding method：CRISPR/Cas9 system editing of the Xa13 promoter to cultivate transgene-free bacterial blight-resistant rice[J].Plant Biotechnology Journal，2020，18（2）：313-315. [69] KIM Y-A，MOON H，PARK C-J.CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae[J].Rice，2019，12（1）：1-13.
[70] ZENG X，LUO Y，VU N T Q，et al.CRISPR/Cas9-mediated mutation of OsSWEET14 in rice cv.Zhonghua11 confers resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae without yield penalty[J].BMC Plant Biology，2020，20（1）：1-11.
[71] 郝巍，紀志远，郑凯丽，等.利用基因组编辑技术创制水稻白叶枯病抗性材料[J].植物遗传资源学报，2018，19（3）：523-530.
[72] 李希陶，刘耀光.基因组编辑技术在水稻功能基因组和遗传改良中的应用[J].生命科学，2016，28（10）：1243-1249.
[73] 刘欣欣，李赫，卜庆云，等.CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用[J].土壤与作物，2021，10（1）：18-26.
[74] 沈明晨，薛超，乔中英，等.CRISPR/Cas9系统在水稻中的发展和利用[J].江苏农业科学，2019，47（10）：5-10.
[75] 郑凯丽，纪志远，郝巍，等.水稻白叶枯病感病相关基因Xig1的分子鉴定及抗病资源创制[J].作物学报，2020，46（9）：1332-1339.
[76] KALININA N O，KHROMOV A，LOVE A J，et al.CRISPR Applications in plant virology：Virus resistance and beyond[J].Phytopathology，2020，110：18-28.
[77] WANG M，LU Y，BOTELLA J R，et al.Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system[J].Molecular Plant，2017，10（7）：1007-1010.
[78] MACOVEI A，SEVILLA N R，CANTOS C，et al.Novel alleles of rice eIF4G generated by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis confer resistance to Rice tungro spherical virus[J].Plant Biotechnology Journal，2018，16（11）：1918-1927.
[79] YANG X，ZHOU H，ZHOU X.Rock paper scissors：CRISPR/Cas9-mediated interference with geminiviruses in plants[J].Science China Siences，2019，62：1389-1391.
[80] JI X，ZHANG H，ZHANG Y，et al.Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants[J].Nature Plants，2015，1（10）：1-4.
[81] HUANG R，LI Y，TANG G，et al.Dynamic phytohormone profiling of rice upon rice black-streaked dwarf virus invasion[J].Journal of Plant Physiology，2018，228：92-100.
[82] YANG X，CHEN B，ZHANG T，et al.Geographic distribution and genetic diversity of rice stripe mosaic virus in southern China[J].Frontiers in Microbiology，2018，9：3068.
[83] VARANDA C M R，FLIX M DO R，CAMPOS M D，et al.Plant viruses：From targets to tools for CRISPR[J].Viruses，2021，13（1）：1-19.
[84] ZHANG T，ZHENG Q，YI X，et al.Establishing RNA virus resistance in plants by harnessing CRISPR immune system[J].Plant Biotechnology Journal，2018，16（8）：1415-1423.
[85] HONG W J，KIM Y J，KIM E J，et al.CAFRI-Rice：CRISPR applicable functional redundancy inspector to accelerate functional genomics in rice[J].The Plant Journal，2020，104（2）：532-545. [86] MAGALLANES L A M，SIMSEK S.Pathogens control on wheat and wheat flour：A review[J].Cereal Chemistry，2020，98（1）：17-30.
[87] HAWERROTH G，ARAUJO L，RODRIGUES F .Infection process of Gaeumannomyces graminis var.graminis on the roots and culms of rice[J].Journal of Phytopathology，2017，165（10）：692-700.
[88] TOSA Y，TADA S.Operation of resistance genes in wheat to Erysiphe graminis f.sp.tritici against E. graminis f.sp.agropyri[J].NRC Research Press Ottawa，Canada，1990，33（2）：231-234.
[89] WANG S，ZONG Y，Lin Q，et al.Precise，predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC-Cas9[J].Nature Biotechnology，2020，38（12）：1460-1465.
[90] ZHANG Y，PRIBIL M，PALMGREN M，et al.A CRISPR way for accelerating improvement of food crops[J].Nature Food，2020，1（4）：200-205.
[91] GAO C.Genome engineering for crop improvement and future agriculture[J].Cell，2021，184（6）：1621-1635.
[92] ZHU H，LI C，GAO C.Applications of CRISPR-Cas in agriculture and plant biotechnology[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2020，21（11）：661-677.
[93] CHEN K，WANG Y，ZHANG R，et al.CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture[J].Annual Review of Plant Biology，2019，70（1）：667-697.
[94] ZHANG Y，BAI Y，WU G，et al.Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat[J].The Plant Journal，2017，91（4）：714-724.
[95] CHOWDHURY J，SCHOBER M S，SHIRLEY N J，et al.Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene （HvGsl6） in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f.sp.Hordei[J].New Phytologist，2016，212（2）：434-443.
[96] LIU H，WANG K，JIA Z，et al.Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system[J].Journal of Experimental Botany，2020，71（4）：1337-1349.
[97] WANG Y，CHENG X，SHAN Q，et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J].Nature Biotechnology：The Science and Business of Biotechnology，2014，32（9）：947-951.
[98] ASIIMWE T，STEWART L R，WILLIE K，et al.Maize lethal necrosis viruses and other maize viruses in Rwanda[J].Plant Pathology，2020，69（3）：585-597.
[99] YADAVA P，ABHISHEK A，SINGH R，et al.Advances in maize transformation technologies and development of transgenic Maize[J].Frontiers in Plant Science，2017，7：1-12. [100] DAI D，MA Z，SONG R.Maize kernel development[J].Molecular Breeding，2021，41（1）：1-33.
[101] WANG Y，LIU X，ZHENG X，et al.Creation of aromatic maize by CRISPR/Cas[J].Journal of Integrative Plant Biology，2021，1-19.
[102] ZHANG Q，ZHANG Y，LU M H，et al.A novel ternary vector system united with morphogenic genes enhances CRISPR/Cas delivery in maize[J].Plant Physiology，2019，181（4）：1441-1448.
[103] KWEON J，KIM D E，JANG A H，et al.CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries[J].PLoS ONE，2018，13（6）：1-9.
[104] PERRY E D，CILIBERTO F，HENNESSY D A，et al.Genetically engineered crops and pesticide use in U.S.maize and soybeans[J].Science Advances，2016，2：1-8.
[105] BARONE P，WU E，LENDERTS B，et al.Efficient gene targeting in maize using inducible CRISPR-Cas9 and marker-free donor template[J].Molecular Plant，2020，13（8）：1219-1227.
[106] CHILCOAT D，LIU Z-B，SANDER J.Use of CRISPR/Cas9 for crop improvement in maize and soybean[J].Progress in Molecular Biology and Translational Science，2017，149：27-46.
[107] HANSJAKOB A，RIEDERER M，HILDEBRANDT U.Wax matters：absence of very-long-chain aldehydes from the leaf cuticular wax of the glossy11 mutant of maize compromises the prepenetration processes of Blumeria graminis[J].Plant Pathology，2011，60（6）：1151-1161.
[108] LIU Y，ZHU A，TAN H，et al.Engineering banana endosphere microbiome to improve Fusarium wilt resistance in banana[J].BioMed Central，2019，7（1）：1-15.
[109] CORDOBA L，SILVA R，GOMES D，et al.Brazilian green banana[J].Journal of Thermal Analysis and Calorimetry，2018，134（3）：2065-2973.
[110] TRIPATHI L，NTUI V O，TRIPATHI J N，et al.Application of CRISPR/Cas for diagnosis and management of viral diseases of banana [J].Frontiers in Microbiology，2021，11：1-13.
[111] TSANNI A.Top banana：developing varieties that resist disease[J].Nature，2020，587（7834）：514.
[112] KWEON J，KIM D E，JANG A H，et al.CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries[J].PLoS ONE，2018，13（6）：1-9.
[113] NAIM F，DUGDALE B，KLEIDON J，et al.Gene editing the phytoene desaturase alleles of Cavendish banana using CRISPR/Cas9[J].Transgenic Research，2018，27（5）：451-460.
[114] TRIPATHI J N，NTUI V O，RON M，et al.CRISPR/Cas9 editing of endogenous banana streak virus in the B genome of Musa spp.overcomes a major challenge in banana breeding[J].Communications Biology，2019，2（1）：1-11. [115] KAUR N，ALOK A，SHIVANI，et al.CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase （PDS） demonstrates precise manipulation in banana cv.Rasthali genome[J].Functional & Integrative Genomics，2018，18（1）：89-99.
[116] SHAO X，WU S，DOU T，et al.Using CRISPR/Cas9 genome editing system to create MaGA20ox2 gene-modified semi-dwarf banana[J].Plant Biotechnology Journal，2019，18（1）：17-19.
[117] MAXMEN A.CRISPR might be the banana’s only hope against a deadly fungus[J].Nature：International Weekly Journal of Science，2019，574（7776）：1-5.
[118] 胡春华，邓贵明，孙晓玄，等.香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立[J].中国农业科学，2017，50（7）：1294-1301.
[119] PEER R，RIVLIN G，GOLOBOVITCH S，et al.Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in perennial fruit trees[J].Planta，2015，241（4）：941-951.
[120] JIANG W Z，YANG B，WEEKS D P.Efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations[J].PLoS ONE，2017，9（6）：e99225.
[121] WU R，LUCKE M，JANG Y，et al.An efficient CRISPR vector toolbox for engineering large deletions in Arabidopsis thaliana[J].Plant Methods，2018，14（1）：65.
[122] ZHANG Z，MAO Y，HA S，et al.A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis[J].Plant Cell Reports，2016，35（7）：1519-1533.
[123] JIANG W，ZHOU H，BI H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].Nucleic Acids Research，2013，41（20）：e188.
[124] FENG Z，MAO Y，XU N，et al.Multigeneration analysis reveals the inheritance，specificity，and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2014，111（12）：4632-4637.
[125] MERKER L，SCHINDELE P，HUANG T-K，et al.Enhancing in planta gene targeting efficiencies in Arabidopsis using temperature-tolerant CRISPR/ LbCas12a[J].Plant Biotechnology，2020，18：2382-84.
[126] AMAN R，MAHAS A，BUTT H，et al.Engineering RNA virus interference via the CRISPR/Cas13 machinery in Arabidopsis[J].Viruses，2018，10（12）：1-9.
[127] 張思琦，何佳，贺凌霄，等.基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析[J].烟草科技，2020，53（5）：17-25.
[128] 姚恒，杨大海，白戈，等.利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1[J].生物技术通报，2018，34（11）：97-102.
[129] 姚恒，白戈，谢贺，等.利用CRISPR/Cas9技术创制烟草NtabMYC2基因的定点突变[J].分子植物育种，2017，15（6）：2328-2334.
[130] GAO J，WANG G，MA S，et al.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J].Plant Molecular Biology，2015，87：99-110. [131] RUYI R，QIANG Z，FUTAI N，et al.Breeding for PVY resistance in tobacco LJ911 using CRISPR/Cas9 technology[J].Crop Breeding and Applied Biotechnology，2021，21（1）：1-6.
[132] ZHANG T，ZHAO Y，YE J，et al.Establishing CRISPR/Cas13a immune system conferring RNA virus resistance in both dicot and monocot plants[J].Plant Biotechnology Journal，2019，17（7）：1185-1187.
[133] 馮吉，程玲，蔡长春.基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究[J/OL].中国烟草科学，2021，1-8.
[134] 刘翠花.烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究[D].重庆：西南大学，2020.
[135] DENG L，WANG H，SUN C，et al.Efficient generation of pink-fruited tomatoes using CRISPR/Cas9 system[J].Journal of Genetics and Genomics，2018，45（1）：51-54.
[136] BROOKS C，NEKRASOV V，LIPPMAN Z B，et al.Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 system[J].Plant Physiology，2014，166（3）：1292-1297.
[137] THOMAZELLA D，BRAIL Q，DAHLBECK D，et al.CRISPR-Cas9 mediated mutagenesis of a DMR6 ortholog in tomato confers broad-spectrum disease resistance[J].Biorxiv，2016，1-23.
[138] SHARMA S，BHATTARAI K.Progress in developing bacterial spot resistance in tomato[J].Agronomy，2019，9（1）：1-11.
[139] KIEU N P，LENMAN M，WANG E S，et al.Mutations introduced in susceptibility genes through CRISPR/Cas9 genome editing confer increased late blight resistance in potatoes[J].Scientific Reports，2021，11：1-12.
[140] JOHANSEN I E，LIU Y，JRGENSEN B，et al.High efficacy full allelic CRISPR/Cas9 gene editing in tetraploid potato[J].Scientific Reports，2019，9（1）：1-7.
[141] LI T，YANG X，YU Y，et al.Domestication of wild tomato is accelerated by genome editing[J].Nature biotechnology：The Science and Business of Biotechnology，2018，36（12）：1160-1163.
[142] WANG T，ZHANG H，ZHU H.CRISPR technology is revolutionizing the improvement of tomato and other fruit crops[J].Horticulture Research，2019，6（1）：1-13.
[143] 谢胜松，张懿，张利生，等.CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J].遗传，2015，37（11）：1125-1136.
[144] 郑武，谷峰.CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J].遗传，2015，37（10）：1003-1010.
[145] ZUO E，SUN Y，WEI W，et al.Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos[J].Science （New York，N.Y.），2019，364（6437）：289-292.
[146] MAHER M F，NASTI R A，VOLLBRECHT M，et al.Plant gene editing through de novo induction of meristems[J].Nature Biotechnology.2020，38（1）：84-89. [147] LEI Y，LU L，LIU HY，et al.CRISPR-P：A web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-System in plants[J].Molecular Plant，2014，7（9）.
[148] 朱晓菲，黄娇媚，原昊，等.Class2 CRISPR-Cas系统发掘及分析方法[J].热带生物学报，2021，12（1）：115-123.
[149] 曹林艳，王青豪，唐林，等.双歧杆菌中CRISPR-Cas系统生物信息学分析[J].中国微生态学杂志，2020，32（11）：1241-1247.
[150] ALKHNBASHI O S，MEIER T，MITROFANOV A，et al.CRISPR-Cas bioinformatics[J].Methods，2020，172：3-11.
[151] GAO C.The future of CRISPR technologies in agriculture[J].Nature Reviews.Molecular Cell Biology，2018，19（5）：275-276.
[152] 张昆，陈景超，李祎，等.CRISPR/Cas9技术在微生物研究中的应用进展[J].微生物學通报，2018，45（2）：451-464.
[153] AHMAD S，WEI X，SHENG Z，et al.CRISPR/Cas9 for development of disease resistance in plants：recent progress，limitations and future prospects[J].Briefings in Functional Genomics，2020，19（1）：26-39.
[154] 任明见.小麦优质亚基和抗白粉病基因聚合体的标记辅助选择研究[J].山地农业生物学报，2009，28（4）：283-287.
[155] 肖仲久，佀胜利，李小霞，等.小麦主要病害的抗病基因研究进展[J].山地农业生物学报，2007（2）：171-178.