【摘 要】
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为了优化以土壤微生物DNA为模板的PCR反应条件,采用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取土壤微生物总DNA,对16SrDNA V3可变区的PCR反应体系和反应条件进行优化。主要从DNA模板用
【机 构】
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郑州大学化工与能源学院,河南农业大学烟草学院,
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为了优化以土壤微生物DNA为模板的PCR反应条件,采用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取土壤微生物总DNA,对16SrDNA V3可变区的PCR反应体系和反应条件进行优化。主要从DNA模板用量、引物浓度、退火温度、热启动方式4个方面进行筛选试验,最后得出最适宜的土壤DNA扩增体系为:10.5ng模板DNA、5μL 10×buffer、4μL 2.5mmol/L dNTP、10μmol/L引物各1.5μL,2.5UTaq酶,加无菌ddH2O补足至50μL;PCR循环程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸70s,29个循环;72℃延伸5min。试验结果表明:选择热启动方式和合适的退火温度是获得高质量PCR产物的关键。
In order to optimize the PCR reaction conditions using soil microbial DNA as template, the total DNA of soil microorganism was extracted by E.Z.N.A.soil DNA kit, and the PCR reaction system and reaction conditions of 16SrDNA V3 variable region were optimized. The results showed that the most suitable soil DNA amplification system was 10.5ng template DNA, 5μL 10 × buffer, 4μL 2.5mmol / L dNTP, 10μmol / L primer 1.5μL each, 2.5UTaq enzyme plus sterile ddH2O make up to 50μL; PCR cycle program: 94 ℃ denaturation 5min; 94 ℃ denaturation 1min, 52 ℃ annealing 1min, 72 ℃ extension 70s, 29 Circulation; 72 ° C extension 5min. The experimental results show that choosing the hot-start mode and the proper annealing temperature are the keys to obtain high-quality PCR products.
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