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摘 要：目的：探讨血清miR-106b-3p和miR-214对食管鳞癌的诊断价值。方法：采用RT-qPCR技术检测ESCC患者和健康者血清中miR-106b-3p及miR-214的水平，结合临床病理资料，探讨它们之间的关系。结论：miR-106b-3p、miR-214在ESCC患者血清中升高，可作为新的肿瘤标志物协助ESCC的诊断。
关键词：食管鳞癌；血清；miR-106b-3p；miR-214；
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是调节人类表观遗传的重要分子之一，广泛参与人类大多数癌症的分子调节过程[1]。研究发现，诸多miRNAs与食管癌的发生、发展有着密切联系。关于miRNA-106b-3p（miR-106b-3p）和miRNA-214（miR-214）在ESCC中的具体功能，目前较少报道。本研究采用RT-qPCR技术检测ESCC患者和健康者的血清中miR-106b-3p和miR-214表达水平，并结合临床病理资料，探讨它们与ESCC的关系。
材料和方法
1.研究对象
1.1 ESCC患者：取2016年07月至2016年12月邯郸市第一医院及苏州大学附属第一医院确诊的ESCC患者的外周血，共45例。其中男性26例，女性19例，年龄36～79岁，平均年龄61.2±11.1岁。每位患者均无其他肿瘤病史，采取外周血标本前及手术前均未行放疗、化疗、生物治疗等干预措施。
1.2健康体检者：收集40例同期健康体检志愿者的外周血，与ESCC患者在性别、年龄等情况无统计学差异（P>0.05），具有可比性。
2.主要试剂
Trizol试剂及逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，PCR试剂盒购于德国Roche公司，引物由南京金斯瑞公司合成。
3.方法
3.1标本采集与处理
采集ESCC患者和健康体检者空腹静脉血3mL，静置40min，4℃3500×g离心10min，取上清液放入新的EP管中，放置-80℃冰箱中待用。
3.2血浆中总的RNA的提取
按说明书提取总RNA。测定总RNA纯度合格后用于后续实验。
3.3反转录反应
按照试剂盒说明进行反转录反应，将产物cDNA于-20℃保存备用。
3.4实时荧光定量PCR反应
以Roche公司的荧光定量PCR试剂盒来扩增目的基因，miRNA含量采用相对表达量2-△△Ct表示。
4.统计学处理
采用GraphPad5.0软件分析数据，多组间数据比较采用方差分析，两组间数据比较采用t检验，采用ROC曲线分析miR-106b-3p及miR-214对ESCC诊断价值，P<0.05表示有统计学差异。
结 果
1.食管鳞癌患者和健康体检者的血清miR-106b-3p、miR-214表達情况
在食管鳞癌患者术前的血清中miR-106b-3p、miR-214表达量分别为0.681±0.14及0.830±0.15，健康体检者的血清中miR-106b-3p、miR-214表达量为分别为0.20±0.03及0.27±0.05，两者与健康组相比存在显著差异，具有统计学意义。
2.miR-106b-3p及miR-214的表达与临床病理特征之间的关系
通过对临床及病理资料的分析，发现食管鳞癌患者血清miR-106b-3p及miR-214随着患者TNM分期增加及淋巴结转移而明显上调，差异有统计学意义（p<0.05），而与患者年龄、性别无关（p>0.05）。
3.血清miR-106b-3p和miR-214诊断食管鳞癌的价值
经过ROC曲线分析显示，术前血清miR-106b-3p相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.168，AUC为0.831，敏感性为74.8%、特异性为82.1%。术前血清miR-214相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.168，AUC为0.830，敏感性为76.9%、特异性为84.6%。
讨 论
miRNAs是一类非编码小分子RNA，miR-106b-3p是miR-106b的一种主要形式，李元梅等研究显示，miR-106b在甲状腺癌组织中的表达水平显著低于相应癌旁组织，提示其在甲状腺癌的发生发展中发挥抑癌基因作用[2]，Liang等检测了肝癌患者组织标本，结果示miR-106b在肝癌组织明显上调，然而迄今为止，关于miR-106b-3p在ESCC中表达和功能的研究尚未有报道。本实验结果显示ESCC患者的血清miR-106b-3p表达水平明显高于健康者（P﹤0.01），和既往报道miR-106b的表达相似，说明miR-106b-3p可作为一个新的生物学标志，在临床上可通过检测血清miR-106b-3p来协助ESCC的诊断。
miR-214是 miRNAs 家族的重要成员，外周血miRNAs 受内源性RNA酶保护而不被降解，具有较好的特异性和稳定性，可稳定存在于血液、尿液等体液中[3]。Pang等发现，miR-214 在肝癌组织中表达下降，Yang 等研究显示，miR-214在胃癌组织及细胞中均升高。miR-214在ESCC的表达，卢琪珏的研究显示其在ESCC组织中的表达下降，认为miR-214在ESCC中为抑癌基因，而QIAO等研究发现是致癌基因。关于ESCC患者血清miR-214的表达情况，目前尚未见报道。本研究通过RT-qPCR 检测ESCC患者及健康人群血清miR-214 表达水平，发现ESCC患者的血清miR-214表达水平明显高于健康者（P﹤0.01），miR-214表达水平与ESCC分期及淋巴结转移情况有关，ROC曲线分析显示其可作为区分ESCC与健康者的分子标志物，因此，临床上miR-214可作为新的辅助诊断ESCC的血液肿瘤标志物。
总之，血清miR-106b-3p、miR-214在ESCC中上调，其表达水平反映了ESCC的进展情况，可作为ESCC新的肿瘤分子标志物及判断预后指标，对ESCC的临床诊治具有一定的应用价值。
参考文献：
[1] Rupaimoole R，Slack FJ.MicroRNA therapeutics：towards a new era for the management of cancer and other diseases.Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：203-222.
[2] 李元梅，孙利敏，王媛媛，等.microRNA-106b在甲状腺癌中表达的临床意义及生物学功能[J].中华内分泌外科杂志，2017，11（1）：60-64.
[3] Penna E，Orso F，Taverna D.MiR-214 as a key hub that controls cancer networks：small player，multiple functions [J].J Invest Dermatol，2015，135（4）：960-969.
关键词：食管鳞癌；血清；miR-106b-3p；miR-214；
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是调节人类表观遗传的重要分子之一，广泛参与人类大多数癌症的分子调节过程[1]。研究发现，诸多miRNAs与食管癌的发生、发展有着密切联系。关于miRNA-106b-3p（miR-106b-3p）和miRNA-214（miR-214）在ESCC中的具体功能，目前较少报道。本研究采用RT-qPCR技术检测ESCC患者和健康者的血清中miR-106b-3p和miR-214表达水平，并结合临床病理资料，探讨它们与ESCC的关系。
材料和方法
1.研究对象
1.1 ESCC患者：取2016年07月至2016年12月邯郸市第一医院及苏州大学附属第一医院确诊的ESCC患者的外周血，共45例。其中男性26例，女性19例，年龄36～79岁，平均年龄61.2±11.1岁。每位患者均无其他肿瘤病史，采取外周血标本前及手术前均未行放疗、化疗、生物治疗等干预措施。
1.2健康体检者：收集40例同期健康体检志愿者的外周血，与ESCC患者在性别、年龄等情况无统计学差异（P>0.05），具有可比性。
2.主要试剂
Trizol试剂及逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，PCR试剂盒购于德国Roche公司，引物由南京金斯瑞公司合成。
3.方法
3.1标本采集与处理
采集ESCC患者和健康体检者空腹静脉血3mL，静置40min，4℃3500×g离心10min，取上清液放入新的EP管中，放置-80℃冰箱中待用。
3.2血浆中总的RNA的提取
按说明书提取总RNA。测定总RNA纯度合格后用于后续实验。
3.3反转录反应
按照试剂盒说明进行反转录反应，将产物cDNA于-20℃保存备用。
3.4实时荧光定量PCR反应
以Roche公司的荧光定量PCR试剂盒来扩增目的基因，miRNA含量采用相对表达量2-△△Ct表示。
4.统计学处理
采用GraphPad5.0软件分析数据，多组间数据比较采用方差分析，两组间数据比较采用t检验，采用ROC曲线分析miR-106b-3p及miR-214对ESCC诊断价值，P<0.05表示有统计学差异。
结 果
1.食管鳞癌患者和健康体检者的血清miR-106b-3p、miR-214表達情况
在食管鳞癌患者术前的血清中miR-106b-3p、miR-214表达量分别为0.681±0.14及0.830±0.15，健康体检者的血清中miR-106b-3p、miR-214表达量为分别为0.20±0.03及0.27±0.05，两者与健康组相比存在显著差异，具有统计学意义。
2.miR-106b-3p及miR-214的表达与临床病理特征之间的关系
通过对临床及病理资料的分析，发现食管鳞癌患者血清miR-106b-3p及miR-214随着患者TNM分期增加及淋巴结转移而明显上调，差异有统计学意义（p<0.05），而与患者年龄、性别无关（p>0.05）。
3.血清miR-106b-3p和miR-214诊断食管鳞癌的价值
经过ROC曲线分析显示，术前血清miR-106b-3p相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.168，AUC为0.831，敏感性为74.8%、特异性为82.1%。术前血清miR-214相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.168，AUC为0.830，敏感性为76.9%、特异性为84.6%。
讨 论
miRNAs是一类非编码小分子RNA，miR-106b-3p是miR-106b的一种主要形式，李元梅等研究显示，miR-106b在甲状腺癌组织中的表达水平显著低于相应癌旁组织，提示其在甲状腺癌的发生发展中发挥抑癌基因作用[2]，Liang等检测了肝癌患者组织标本，结果示miR-106b在肝癌组织明显上调，然而迄今为止，关于miR-106b-3p在ESCC中表达和功能的研究尚未有报道。本实验结果显示ESCC患者的血清miR-106b-3p表达水平明显高于健康者（P﹤0.01），和既往报道miR-106b的表达相似，说明miR-106b-3p可作为一个新的生物学标志，在临床上可通过检测血清miR-106b-3p来协助ESCC的诊断。
miR-214是 miRNAs 家族的重要成员，外周血miRNAs 受内源性RNA酶保护而不被降解，具有较好的特异性和稳定性，可稳定存在于血液、尿液等体液中[3]。Pang等发现，miR-214 在肝癌组织中表达下降，Yang 等研究显示，miR-214在胃癌组织及细胞中均升高。miR-214在ESCC的表达，卢琪珏的研究显示其在ESCC组织中的表达下降，认为miR-214在ESCC中为抑癌基因，而QIAO等研究发现是致癌基因。关于ESCC患者血清miR-214的表达情况，目前尚未见报道。本研究通过RT-qPCR 检测ESCC患者及健康人群血清miR-214 表达水平，发现ESCC患者的血清miR-214表达水平明显高于健康者（P﹤0.01），miR-214表达水平与ESCC分期及淋巴结转移情况有关，ROC曲线分析显示其可作为区分ESCC与健康者的分子标志物，因此，临床上miR-214可作为新的辅助诊断ESCC的血液肿瘤标志物。
总之，血清miR-106b-3p、miR-214在ESCC中上调，其表达水平反映了ESCC的进展情况，可作为ESCC新的肿瘤分子标志物及判断预后指标，对ESCC的临床诊治具有一定的应用价值。
参考文献：
[1] Rupaimoole R，Slack FJ.MicroRNA therapeutics：towards a new era for the management of cancer and other diseases.Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：203-222.
[2] 李元梅，孙利敏，王媛媛，等.microRNA-106b在甲状腺癌中表达的临床意义及生物学功能[J].中华内分泌外科杂志，2017，11（1）：60-64.
[3] Penna E，Orso F，Taverna D.MiR-214 as a key hub that controls cancer networks：small player，multiple functions [J].J Invest Dermatol，2015，135（4）：960-969.