论文部分内容阅读
摘要：以华130B为稻瘟病抗性基因的供体、圣稻15为受体，通过回交转育结合分子标记辅助选择，选育出综合性状优良的Pi1单基因株系4个、Pi2单基因株系3个、Pi1和Pi2双基因聚合系3个。稻瘟病田间抗性自然鉴定结果表明，单基因系抗级为3级，表现为中抗；双基因聚合系抗级为1级，表现为高抗；而对照圣稻15抗级为7级，表现为高感。说明通过分子标记辅助选择转育Pi1和Pi2基因能显著提高水稻稻瘟病抗性，同时表明双基因聚合系抗性明显好于单基因系。
关键词：水稻；稻瘟病；分子标记辅助选择；抗性鉴定
中图分类号：S511.2+20.34 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0018-04
Abstract Using Hua 130B as donor of rice blast resistance genes and Shengdao 15 as recipient， ten lines including four lines with Pi1 gene， three lines with Pi2 gene and three double gene-pyramided lines were developed by back-cross breeding with molecular marker-assisted selection， and these lines showed desirable agronomic traits in the field. The natural evaluation results of rice blast resistance in field showed that the disease resistance grade of single gene lines and double gene-pyramided lines were 3 and 1 respectively， showing high resistance. The resistance grade of Shengdao 15 was 7， so it was highly susceptible. This research indicated that breeding of Pi1 and Pi2 using molecular marker-assisted selection could significantly improve the resistance to rice blast， and it also showed that the resistance of double gene-pyramided lines was significantly better than that of single gene lines.
Keywords Rice； Rice blast； Molecular marker-assisted selection； Resistance identification
稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporche oryzae）引起的水稻生产上的重要病害之一，在世界范围内都有不同程度的发生，严重的甚至颗粒无收[1]。在我国水稻产区，稻瘟病呈现逐年上升的趋势，成为最主要的病害，给水稻生产造成巨大损失[2，3]。用化学农药防治稻瘟病，不仅会使种植成本升高，还会造成农药残留和环境污染。培育和种植带有稻瘟病广谱抗性基因的水稻是防治稻瘟病最经济有效的方法[4]。
近年来，水稻稻瘟病的研究越来越受到人们重视。目前已鉴定出68个稻瘟病基因座上的83个主效基因，其中23个稻瘟病基因已被克隆[5]。Pi1和Pi2是两个稻瘟病抗性广谱基因，对我国不同稻瘟病菌生理小种具有广谱抗性，已被应用于水稻育种中[6-8]。刘士平等（2003）[9]对Pi1、Pi2和Pi3基因进行聚合和接种鉴定，大大提高了水稻品种对稻瘟病的抗性。柳武革等[6]利用分子标记辅助选择对Pi1和Pi2基因进行转育和聚合，培育出5个纯合的双基因聚合系，综合抗性达到高抗水平。胡杰等[8]利用分子标记辅助选择将Pi1和Pi2聚合到保持系97B中，在田间自然发病条件下，双基因聚合系穗颈瘟的抗性为1级，表现为高抗。陈红旗等[7]将Pi1、Pi2和Pi3聚合到保持系金23B中，育成的改良系大大提高了对稻瘟病的抗性。随着研究的深入，越来越多的稻瘟病抗性基因被挖掘、定位和克隆，加上成熟的分子标记辅助选择体系，为稻瘟病抗性基因的利用提供了强有力的技术支撑。拓宽稻瘟病抗性基因资源，提高黄淮区水稻品种对稻瘟病的抗性，是黄淮区水稻生产中亟待解决的问题。
本研究利用携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的华130B为供体亲本，以黄淮区主栽品种圣稻15为受体亲本，通过回交转育和分子标记辅助选择技术，以期培育出综合性状优良、抗稻瘟病的粳稻新品系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供体亲本华130B，由华中农业大学作物遗传改良重点实验室何予卿教授提供，受体圣稻15由本实验室保存。
1.2 杂交和选择程序
以圣稻15作母本、华130B作父本杂交获得F1代杂交种，然后以圣稻15作轮回亲本连续回交3次，再自交3次获得 BC3F4株系。在回交过程中从BC1F1开始用分子标记检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，选择带有目的基因且农艺性状偏向圣稻15的单株作母本。在 BC3F4中选择农艺性状优良的株系进行Pi1和Pi2目的基因的检测，选出纯合稳定的株系。
1.3 Pi1、Pi2基因的分子标记检测
Pi1基因的分子标记检测是利用紧密连锁的SSR标记RM144（RM144 F：5′-TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC-3′；RM144R：5′-GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG-3′）和RM224（RM224F：5′-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3′，RM224R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′）。Pi2基因的分子标记检测是利用紧密连锁的SSR标记PI31（PI31 F： 5′-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3′，PI31 R： 5′-CGGCAATTGCCACGATGATA-3′）。 20 μL PCR反应体系包括模板DNA 1 μL， 10 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Taq酶1.5 U， 10×PCR buffer （with MgCl2） 2 μL，2 μmol/L引物1.5 μL，其余用ddH2O补齐。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸5 min[10]。反应产物在6%聚丙烯酰胺上电泳，经硝酸银甲醛溶液银染[11]后观察结果。
1.4 稻瘟病抗性鉴定
2015年在山东省济宁市喻屯镇陈庄农场稻瘟病重发区进行稻瘟病自然诱发试验，对BC3F4代10个稳定株系进行鉴定，阳性对照为供体亲本华130B，阴性对照为受体亲本圣稻15，每份材料种植50株。不用任何农药，田间从抽穗到成熟，一直有3～5 cm的水层，保持田间湿润，易于稻瘟病的发生，于水稻成熟期进行田间稻瘟病发病情况调查。稻瘟病抗性评价标准参照杨仕华等[12]的方法。
2 结果与分析
2.1 Pi1和Pi2基因纯合株系的获得
首先，利用与Pi1和Pi2基因紧密连锁的SSR标记RM144和PI31对抗性基因供体亲本华130B和受体亲本圣稻15进行多态性分析，发现RM144和PI31在供体和受体亲本中有多态性。然后利用RM144和PI31进行分子标记辅助选择。先利用RM144和PI31对F1植株进行扩增，选择带型为杂合带的真杂种与圣稻15回交得到BC1F1。对BC1F1单株继续进行分子标记鉴定，选择带有Pi1和Pi2基因的单株，用圣稻15作父本，继续回交，得到BC2F1。在BC2F1继续选择阳性株进行回交，得到BC3F1。然后自交，对其BC3F2至BC3F4代，利用SSR标记对分离群体进行扩增（图1、2，以BC3F2为例），选择带有Pi1和Pi2基因的单株，每代分单株收获后按株系种植，成熟后选择农艺性状优良的单株。在BC3F4代获得Pi1和Pi2基因纯合的株系，其中获得带有Pi1基因的纯合稳定株系8个、带有Pi2基因的纯合稳定株系9个、带有Pi1和Pi2双基因的纯合稳定株系5个。根据农艺性状表现，选出综合性状优良的Pi1单基因株系4个、Pi2单基因株系3个、Pi1和Pi2双基因聚合系3个，进行稻瘟病田间抗性鉴定。
2.2 Pi1和Pi2单基因纯合系及双基因聚合系稻瘟病抗性鉴定
2015年在济宁市喻屯镇陈庄农场稻瘟病重发区对10个带有单基因和双基因的稳定纯合株系进行稻瘟病抗性鉴定。结果表明，10个株系的抗病等级为1～3，表现为抗，其抗性与供体亲本华130B在同一个水平上，而圣稻15表现为感，抗病等级为7（表1）。从表1可以看出，含不同抗性基因的材料对稻瘟病菌表现出不同的抗性，单基因系对稻瘟病菌的抗病等级为3级，双基因系对稻瘟病的抗病等级为1级，两基因累加系的抗性明显强于单基因系。根据本研究，Pi1和Pi2转育材料对山东稻瘟病菌群的抗性有明显的提高，说明利用分子标记辅助选择培育带有Pi1和Pi2稻瘟病抗性基因的水稻材料可以有效提高水稻品种对稻瘟病的抗性。
3 讨论
山东省生产上应用的水稻品种稻瘟病抗性不强，特别是一些近几年生产上审定的品种，田间也表现高感稻瘟病，限制了其推广应用。2015年参加山东省区试的水稻品种经稻瘟病菌接种鉴定，仅有一个品种抗病级别达到3级，其余都在5～9级。本研究以带有Pi1和 Pi2的华130B为供体亲本，通过回交转育培育的带有Pi1 和 Pi2的单基因系和双基因系，抗性级别达到3级或3级以上，与对照品种圣稻15相比，稻瘟病抗性得到了明显改良。下一步我们将利用这些材料进行进一步的转育，培育农艺性状优良的高抗稻瘟病水稻新品系。
参 考 文 献：
[1] Dean R A，Talbot N J， Ebbole D J， et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Nature， 2005， 434：980-986.
[2] 孙国昌，杜新法，陶荣祥，等.水稻稻瘟病防治研究进展和21世纪初研究设想[J]. 植物保护学报，2000，26（1）：33-35.
[3] 全国农业技术推广中心.2012年全国农作物重大病虫害呈重发态势[J].农药市场信息，2012（5）：49.
[4] Zhang Y X， Yang J Y， Shan Z L， et al. Substitution mapping of QTLs for blast resistance with SSSLs in rice （Oryza sativa L.） [J].Euphytica， 2012， 184（1）：141-150.
[5] 国家水稻数据中心. http：/ /www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.
[6] 柳武革，王丰，金素娟，等. 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系的稻瘟病抗性[J]. 作物学报，2008，34（7）： 1128-1136.
[7] 陈红旗，陈宗祥，倪深，等. 利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 中国水稻科学，2008， 22（1）：23-27.
[8] 胡杰，李信，吴昌军，等. 利用分子标记辅助选择改良杂交水稻的褐飞虱和稻瘟病抗性[J].分子植物育种，2010，6（8）：1180-1187.
[9] 刘士平，李信，汪朝阳，等.基因聚合对水稻稻瘟病的抗性影响[J]. 分子植物育种，2003，1（1）：22-26.
[10]Panaud O， Chen X， McCouch S R. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism （SSLP） in rice （Oryza sativa L.） [J]. Mol. Gen. Genet.， 1996， 252： 597-607.
[11]Li W T， Zeng R Z， Zhang Z M， et al. Mapping of S-b locus for F1 pollen sterility in cultivated rice using PCR based markers[J]. Acta Bot. Sinica， 2002， 44： 463-467.
[12]杨仕华，廖琴. 中国水稻品种试验与审定[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2005：32-35.
关键词：水稻；稻瘟病；分子标记辅助选择；抗性鉴定
中图分类号：S511.2+20.34 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0018-04
Abstract Using Hua 130B as donor of rice blast resistance genes and Shengdao 15 as recipient， ten lines including four lines with Pi1 gene， three lines with Pi2 gene and three double gene-pyramided lines were developed by back-cross breeding with molecular marker-assisted selection， and these lines showed desirable agronomic traits in the field. The natural evaluation results of rice blast resistance in field showed that the disease resistance grade of single gene lines and double gene-pyramided lines were 3 and 1 respectively， showing high resistance. The resistance grade of Shengdao 15 was 7， so it was highly susceptible. This research indicated that breeding of Pi1 and Pi2 using molecular marker-assisted selection could significantly improve the resistance to rice blast， and it also showed that the resistance of double gene-pyramided lines was significantly better than that of single gene lines.
Keywords Rice； Rice blast； Molecular marker-assisted selection； Resistance identification
稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporche oryzae）引起的水稻生产上的重要病害之一，在世界范围内都有不同程度的发生，严重的甚至颗粒无收[1]。在我国水稻产区，稻瘟病呈现逐年上升的趋势，成为最主要的病害，给水稻生产造成巨大损失[2，3]。用化学农药防治稻瘟病，不仅会使种植成本升高，还会造成农药残留和环境污染。培育和种植带有稻瘟病广谱抗性基因的水稻是防治稻瘟病最经济有效的方法[4]。
近年来，水稻稻瘟病的研究越来越受到人们重视。目前已鉴定出68个稻瘟病基因座上的83个主效基因，其中23个稻瘟病基因已被克隆[5]。Pi1和Pi2是两个稻瘟病抗性广谱基因，对我国不同稻瘟病菌生理小种具有广谱抗性，已被应用于水稻育种中[6-8]。刘士平等（2003）[9]对Pi1、Pi2和Pi3基因进行聚合和接种鉴定，大大提高了水稻品种对稻瘟病的抗性。柳武革等[6]利用分子标记辅助选择对Pi1和Pi2基因进行转育和聚合，培育出5个纯合的双基因聚合系，综合抗性达到高抗水平。胡杰等[8]利用分子标记辅助选择将Pi1和Pi2聚合到保持系97B中，在田间自然发病条件下，双基因聚合系穗颈瘟的抗性为1级，表现为高抗。陈红旗等[7]将Pi1、Pi2和Pi3聚合到保持系金23B中，育成的改良系大大提高了对稻瘟病的抗性。随着研究的深入，越来越多的稻瘟病抗性基因被挖掘、定位和克隆，加上成熟的分子标记辅助选择体系，为稻瘟病抗性基因的利用提供了强有力的技术支撑。拓宽稻瘟病抗性基因资源，提高黄淮区水稻品种对稻瘟病的抗性，是黄淮区水稻生产中亟待解决的问题。
本研究利用携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的华130B为供体亲本，以黄淮区主栽品种圣稻15为受体亲本，通过回交转育和分子标记辅助选择技术，以期培育出综合性状优良、抗稻瘟病的粳稻新品系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供体亲本华130B，由华中农业大学作物遗传改良重点实验室何予卿教授提供，受体圣稻15由本实验室保存。
1.2 杂交和选择程序
以圣稻15作母本、华130B作父本杂交获得F1代杂交种，然后以圣稻15作轮回亲本连续回交3次，再自交3次获得 BC3F4株系。在回交过程中从BC1F1开始用分子标记检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，选择带有目的基因且农艺性状偏向圣稻15的单株作母本。在 BC3F4中选择农艺性状优良的株系进行Pi1和Pi2目的基因的检测，选出纯合稳定的株系。
1.3 Pi1、Pi2基因的分子标记检测
Pi1基因的分子标记检测是利用紧密连锁的SSR标记RM144（RM144 F：5′-TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC-3′；RM144R：5′-GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG-3′）和RM224（RM224F：5′-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3′，RM224R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′）。Pi2基因的分子标记检测是利用紧密连锁的SSR标记PI31（PI31 F： 5′-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3′，PI31 R： 5′-CGGCAATTGCCACGATGATA-3′）。 20 μL PCR反应体系包括模板DNA 1 μL， 10 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Taq酶1.5 U， 10×PCR buffer （with MgCl2） 2 μL，2 μmol/L引物1.5 μL，其余用ddH2O补齐。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸5 min[10]。反应产物在6%聚丙烯酰胺上电泳，经硝酸银甲醛溶液银染[11]后观察结果。
1.4 稻瘟病抗性鉴定
2015年在山东省济宁市喻屯镇陈庄农场稻瘟病重发区进行稻瘟病自然诱发试验，对BC3F4代10个稳定株系进行鉴定，阳性对照为供体亲本华130B，阴性对照为受体亲本圣稻15，每份材料种植50株。不用任何农药，田间从抽穗到成熟，一直有3～5 cm的水层，保持田间湿润，易于稻瘟病的发生，于水稻成熟期进行田间稻瘟病发病情况调查。稻瘟病抗性评价标准参照杨仕华等[12]的方法。
2 结果与分析
2.1 Pi1和Pi2基因纯合株系的获得
首先，利用与Pi1和Pi2基因紧密连锁的SSR标记RM144和PI31对抗性基因供体亲本华130B和受体亲本圣稻15进行多态性分析，发现RM144和PI31在供体和受体亲本中有多态性。然后利用RM144和PI31进行分子标记辅助选择。先利用RM144和PI31对F1植株进行扩增，选择带型为杂合带的真杂种与圣稻15回交得到BC1F1。对BC1F1单株继续进行分子标记鉴定，选择带有Pi1和Pi2基因的单株，用圣稻15作父本，继续回交，得到BC2F1。在BC2F1继续选择阳性株进行回交，得到BC3F1。然后自交，对其BC3F2至BC3F4代，利用SSR标记对分离群体进行扩增（图1、2，以BC3F2为例），选择带有Pi1和Pi2基因的单株，每代分单株收获后按株系种植，成熟后选择农艺性状优良的单株。在BC3F4代获得Pi1和Pi2基因纯合的株系，其中获得带有Pi1基因的纯合稳定株系8个、带有Pi2基因的纯合稳定株系9个、带有Pi1和Pi2双基因的纯合稳定株系5个。根据农艺性状表现，选出综合性状优良的Pi1单基因株系4个、Pi2单基因株系3个、Pi1和Pi2双基因聚合系3个，进行稻瘟病田间抗性鉴定。
2.2 Pi1和Pi2单基因纯合系及双基因聚合系稻瘟病抗性鉴定
2015年在济宁市喻屯镇陈庄农场稻瘟病重发区对10个带有单基因和双基因的稳定纯合株系进行稻瘟病抗性鉴定。结果表明，10个株系的抗病等级为1～3，表现为抗，其抗性与供体亲本华130B在同一个水平上，而圣稻15表现为感，抗病等级为7（表1）。从表1可以看出，含不同抗性基因的材料对稻瘟病菌表现出不同的抗性，单基因系对稻瘟病菌的抗病等级为3级，双基因系对稻瘟病的抗病等级为1级，两基因累加系的抗性明显强于单基因系。根据本研究，Pi1和Pi2转育材料对山东稻瘟病菌群的抗性有明显的提高，说明利用分子标记辅助选择培育带有Pi1和Pi2稻瘟病抗性基因的水稻材料可以有效提高水稻品种对稻瘟病的抗性。
3 讨论
山东省生产上应用的水稻品种稻瘟病抗性不强，特别是一些近几年生产上审定的品种，田间也表现高感稻瘟病，限制了其推广应用。2015年参加山东省区试的水稻品种经稻瘟病菌接种鉴定，仅有一个品种抗病级别达到3级，其余都在5～9级。本研究以带有Pi1和 Pi2的华130B为供体亲本，通过回交转育培育的带有Pi1 和 Pi2的单基因系和双基因系，抗性级别达到3级或3级以上，与对照品种圣稻15相比，稻瘟病抗性得到了明显改良。下一步我们将利用这些材料进行进一步的转育，培育农艺性状优良的高抗稻瘟病水稻新品系。
参 考 文 献：
[1] Dean R A，Talbot N J， Ebbole D J， et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Nature， 2005， 434：980-986.
[2] 孙国昌，杜新法，陶荣祥，等.水稻稻瘟病防治研究进展和21世纪初研究设想[J]. 植物保护学报，2000，26（1）：33-35.
[3] 全国农业技术推广中心.2012年全国农作物重大病虫害呈重发态势[J].农药市场信息，2012（5）：49.
[4] Zhang Y X， Yang J Y， Shan Z L， et al. Substitution mapping of QTLs for blast resistance with SSSLs in rice （Oryza sativa L.） [J].Euphytica， 2012， 184（1）：141-150.
[5] 国家水稻数据中心. http：/ /www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.
[6] 柳武革，王丰，金素娟，等. 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系的稻瘟病抗性[J]. 作物学报，2008，34（7）： 1128-1136.
[7] 陈红旗，陈宗祥，倪深，等. 利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 中国水稻科学，2008， 22（1）：23-27.
[8] 胡杰，李信，吴昌军，等. 利用分子标记辅助选择改良杂交水稻的褐飞虱和稻瘟病抗性[J].分子植物育种，2010，6（8）：1180-1187.
[9] 刘士平，李信，汪朝阳，等.基因聚合对水稻稻瘟病的抗性影响[J]. 分子植物育种，2003，1（1）：22-26.
[10]Panaud O， Chen X， McCouch S R. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism （SSLP） in rice （Oryza sativa L.） [J]. Mol. Gen. Genet.， 1996， 252： 597-607.
[11]Li W T， Zeng R Z， Zhang Z M， et al. Mapping of S-b locus for F1 pollen sterility in cultivated rice using PCR based markers[J]. Acta Bot. Sinica， 2002， 44： 463-467.
[12]杨仕华，廖琴. 中国水稻品种试验与审定[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2005：32-35.