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[摘 要]DNA检验技术已经在许多研究和应用领域发挥重要的作用，尤其在法医学领域具有重要意义，聚合酶链反应（PCR）扩增技术的发展，也加速了该领域的快速发展，本文就PCR主要技术及其在法医领域中的应用进展作一综述。
[关键词]公安 法医 物证 PCR
中图分类号：ID918 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）10-0191-01
1 前言
聚合酶链反应PCR是近几十年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他生物学方法如核酸杂交和免疫学方法相结应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰，遗传病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查等。法医物证学是具有法学特性的一门应用科学，属于法医学范畴，为司法机关侦破审理提供科学的证据。法医物证又可以称为法医生物物证，包括人体构成成分检材、动物相应的各类检材和部分植物检材，例如人体的各种分泌物及排泄物、血液、毛发、牙齿、骨骼以及植物纤维、种子、花粉等。法医物证涉及多个学科，与现代分子生物学、免疫微生物学、临床医学等多个学科紧密相关，这些学科的高速发展，也相应的推动了法医物证学的跨越式发展。
2 PCR技术
聚合酶链反应PCR技术具有特异、快速、简便等很多优点，在短时间内能将所要研究的目的基因扩增至数万乃至数百万倍。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成，DNA聚合酶以一段单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，在体外通过酶促反应以百万倍扩增一段目的基因。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2.1 常规PCR技术
该技术的主要步骤是首先从细胞中提取RNA，将细胞中mRNA分析出；其次在反转录酶的催化下以mRNA为模板合成DNA；再次以DNA为模板，用PCR进行扩增；最后PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检测。它的主要应用是：该技术主要用于获取目的基因的和合成DNA探针。
2.2 多重PCR技术
多重PCR技术这是一种新型PCR的扩增技术，是对常规PCR的改进，其原理是：设计多对引物同时扩增一份DNA样品中几个不同DNA目的片段。基本步骤与常规PCR操作相同，只是反应中加入的是多对引物，而不是一对引物。主要应用：常用于诊断疾病和法医学研究分析等方面的应用。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段。在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率。
2.3 定量PCR技术
定量PCR技术是指以一种标准作对照，通过对PCR起始模板量进行定量的技术。目前主要采用的定量PCR方法是荧光定量PCR法，荧光定量PCR是一种高度灵敏的核酸定量技术，与传统PCR相比，定量PCR能够更加快速灵敏以及有效地对核酸进行定量检测。荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析。
3 PCR在法医中的应用
3.1 PCR-STR分析技术
STR分析技术被认为是目前国内外法医学个体识别和亲权鉴定的主要研究方向，是第二代法醫DNA指纹技术的核心。STR即短串联重复序列，STR的结构特点很适合PCR扩增，为微量的生物学物证的个体认定提供了技术基础，近年来随着荧光标记技术的出现以及复合扩增技术和自动化测序仪的日趋成熟，STR的灵敏度和个体识别率很高，对指纹和皮肤脱落上皮细胞等微量物证的取证方面发挥了重要作用。复合STR-PCR荧光标记自动检测系统已成为当今法医DNA检验的主要技术手段。
3.2 PCR在物证领域使用注意事项
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但在PCR中普遍遇到的问题是可被寡核苷酸引物扩增的外源DNA序列的污染问题。污染原因有来自实验材料污染、
来自其他测试样品污染，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
3.3 防止污染的方法有
合理分隔实验室。在理想的条件下，PCR应该在一间单独的实验室内进行操作，但是较为实际的选择是在实验室中为设置PCR划出特定的区域：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
4 结语
随着现代分子生物学的迅速发展，科学技术的不断进步，新型PCR仪器及相应试剂、试剂盒、新的凝胶电泳设备的不断出现，PCR技术的实验方法也变得越来越简便、快捷、实用，也向着更加智能化的方向发展。操纵遗传物质来满足生命体的特殊要求，将会给人类的现代生活带来根本性的重大变化。PCR技术使得法医物证技术在法医学已取得了辉煌的成果，解决了法医物证正面认定的历史难题，为法庭科学的发展作出了巨大的贡献，使整个法医物证发生了革命性的变化。
参考文献
[1] 梁国栋.最新分子生物学实验技术[M].北京：科学出版社，2001.
[2] 范维坷.分子生物学[M].重庆：重庆大学出版社，1999.
[3] 廖俊杰，吴英杰.新型DNA聚合酶-pfu酶的研究[J].广东轻工职业技术学院学报，2005（2）：8-10.
作者简介
李恒丽，女，江苏邳州人，新疆阿克苏地区库车县公安局刑事侦查大队，法医师，主要从事物证检验鉴定工作。
曹雨薇，女，山东人，新疆石河子市公安局刑警支队，法医师，主要从事物证检验鉴定工作。
[关键词]公安 法医 物证 PCR
中图分类号：ID918 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）10-0191-01
1 前言
聚合酶链反应PCR是近几十年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他生物学方法如核酸杂交和免疫学方法相结应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰，遗传病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查等。法医物证学是具有法学特性的一门应用科学，属于法医学范畴，为司法机关侦破审理提供科学的证据。法医物证又可以称为法医生物物证，包括人体构成成分检材、动物相应的各类检材和部分植物检材，例如人体的各种分泌物及排泄物、血液、毛发、牙齿、骨骼以及植物纤维、种子、花粉等。法医物证涉及多个学科，与现代分子生物学、免疫微生物学、临床医学等多个学科紧密相关，这些学科的高速发展，也相应的推动了法医物证学的跨越式发展。
2 PCR技术
聚合酶链反应PCR技术具有特异、快速、简便等很多优点，在短时间内能将所要研究的目的基因扩增至数万乃至数百万倍。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成，DNA聚合酶以一段单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，在体外通过酶促反应以百万倍扩增一段目的基因。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2.1 常规PCR技术
该技术的主要步骤是首先从细胞中提取RNA，将细胞中mRNA分析出；其次在反转录酶的催化下以mRNA为模板合成DNA；再次以DNA为模板，用PCR进行扩增；最后PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检测。它的主要应用是：该技术主要用于获取目的基因的和合成DNA探针。
2.2 多重PCR技术
多重PCR技术这是一种新型PCR的扩增技术，是对常规PCR的改进，其原理是：设计多对引物同时扩增一份DNA样品中几个不同DNA目的片段。基本步骤与常规PCR操作相同，只是反应中加入的是多对引物，而不是一对引物。主要应用：常用于诊断疾病和法医学研究分析等方面的应用。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段。在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率。
2.3 定量PCR技术
定量PCR技术是指以一种标准作对照，通过对PCR起始模板量进行定量的技术。目前主要采用的定量PCR方法是荧光定量PCR法，荧光定量PCR是一种高度灵敏的核酸定量技术，与传统PCR相比，定量PCR能够更加快速灵敏以及有效地对核酸进行定量检测。荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析。
3 PCR在法医中的应用
3.1 PCR-STR分析技术
STR分析技术被认为是目前国内外法医学个体识别和亲权鉴定的主要研究方向，是第二代法醫DNA指纹技术的核心。STR即短串联重复序列，STR的结构特点很适合PCR扩增，为微量的生物学物证的个体认定提供了技术基础，近年来随着荧光标记技术的出现以及复合扩增技术和自动化测序仪的日趋成熟，STR的灵敏度和个体识别率很高，对指纹和皮肤脱落上皮细胞等微量物证的取证方面发挥了重要作用。复合STR-PCR荧光标记自动检测系统已成为当今法医DNA检验的主要技术手段。
3.2 PCR在物证领域使用注意事项
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但在PCR中普遍遇到的问题是可被寡核苷酸引物扩增的外源DNA序列的污染问题。污染原因有来自实验材料污染、
来自其他测试样品污染，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
3.3 防止污染的方法有
合理分隔实验室。在理想的条件下，PCR应该在一间单独的实验室内进行操作，但是较为实际的选择是在实验室中为设置PCR划出特定的区域：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
4 结语
随着现代分子生物学的迅速发展，科学技术的不断进步，新型PCR仪器及相应试剂、试剂盒、新的凝胶电泳设备的不断出现，PCR技术的实验方法也变得越来越简便、快捷、实用，也向着更加智能化的方向发展。操纵遗传物质来满足生命体的特殊要求，将会给人类的现代生活带来根本性的重大变化。PCR技术使得法医物证技术在法医学已取得了辉煌的成果，解决了法医物证正面认定的历史难题，为法庭科学的发展作出了巨大的贡献，使整个法医物证发生了革命性的变化。
参考文献
[1] 梁国栋.最新分子生物学实验技术[M].北京：科学出版社，2001.
[2] 范维坷.分子生物学[M].重庆：重庆大学出版社，1999.
[3] 廖俊杰，吴英杰.新型DNA聚合酶-pfu酶的研究[J].广东轻工职业技术学院学报，2005（2）：8-10.
作者简介
李恒丽，女，江苏邳州人，新疆阿克苏地区库车县公安局刑事侦查大队，法医师，主要从事物证检验鉴定工作。
曹雨薇，女，山东人，新疆石河子市公安局刑警支队，法医师，主要从事物证检验鉴定工作。