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摘要[目的]研究玉米秸秆纤维素降解菌的分离与产酶条件。[方法]从富含腐烂玉米秸秆的土壤中分离筛选到1株能降解纤维素的真菌C01，经形态观察和ITS序列分析，初步鉴定该菌种，并对该菌产酶条件进行优化。[结果]玉米秸秆纤维素降解真菌最佳接种种龄5 d，培养液初始pH为5，接种量12%；培养时间5 d的优化条件下，酶活力达1.76 IU/ml。该菌株对玉米秸秆降解效果较好，优化条件下，7 d降解率达66.8%。[结论]该研究可为提高玉米秸秆的利用率提供优质的菌種资源。
关键词玉米秸秆；纤维素降解；分离；产酶条件
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01159-03
基金项目牡丹江市科学技术计划项目（玉米秸秆纤维素降解菌的选育及应用研究，G2013n0012）的阶段性研究成果。
作者简介向殿军（1978-），男，黑龙江望奎人，讲师，博士，从事农业基础研究。*通讯作者，讲师，博士，从事食品基础研究。
纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，占植物干重的1/3～1/2，全球一年间由光合作用生产的纤维素约1.5×109 t[1-2]。我国是一个农业大国，每年的秸秆产量约7.0亿t，其中玉米秸秆占2.2亿t[3]。纤维素中由于存在许多高能的氢键，因此其水解、利用均很困难，89%的秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。秸秆还田可补充土壤有机质，维持土地利用的物质平衡，利于农业可持续发展，是降解秸秆的一种良好途径。相对于间接还田方式，玉米秸秆原位还田可减轻劳动强度，节省成本，已经在农区广为推广应用。然而，我国北方地区玉米收获、秸秆还田是在深秋时节，由于气候干燥、温度偏低，原位还田的玉米秸秆自然腐解速度缓慢，给农业生产带来许多不利影响，导致秸秆还田应用阻力较大，应用面积小，配施适当的秸秆降解菌剂是解决该问题的有效方法[4-5]。但目前纤维素酶生产菌株的酶活力不高，因此筛选高活力的纤维素酶生产菌株是开展秸秆原位还田和堆沤还田的一个关键前提。该研究从常年堆积玉米秸秆的土壤中筛选到1株高纤维素酶活的纤维素降解真菌，通过分子生物学手段对其进行了鉴定，并对其产酶条件进行了初步研究， 以期为提高玉米秸秆的利用率提供优质的菌种资源和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品。土壤样品采集自牡丹江市郊区玉米秸秆堆积处。玉米秸秆为成熟玉米秸秆地上部分，晒干、粉碎过80目筛备用。
1.1.2培养基。玉米秸秆筛选培养基：2%玉米秸秆粉，0.3% NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%琼脂，自然pH。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：1%CMC-Na，0.3%NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%琼脂，自然pH。种子培养基：20%马铃薯，2%蔗糖，自然 pH，固体培养基加入2%琼脂。液体发酵产酶培养基：0.75%玉米秸秆粉，0.75%麸皮，0.5%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨。
1.2试验方法
1.2.1 纤维素分解单菌株的筛选。将玉米秸秆堆腐样品按适当梯度稀释后接种至玉米秸秆筛选培养基上，30 ℃培养3 d进行增殖，挑取单菌落经3次平板划线分离培养获得纯菌落，点接种于CMC-Na平板上，用1 mg/L刚果红溶液染色1 h，再用1 mol/L 的NaCl溶液洗脱1 h后，测水解圈直径。根据D值（D=水解圈直径/天数）的大小进行初筛。将初筛的菌株接种于种子培养基中，30 ℃，180 r/min震荡培养5 d，然后接种到液体发酵产酶培养基中，30 ℃，180 r/min震荡培养5 d，测定羧甲基纤维素酶（CMCase）活力，选取酶活最高的菌株试管斜面保存备用，作为进一步研究的对象。
1.2.2 酶活测定。取发酵液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集上清液即得粗酶液。按宋颖琦等[6]试验方法进行CMC酶活力测定。
1.2.3菌株形态和ITS序列鉴定。将菌株接种到平板上，培养3 d，观察菌落的特征。在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上，染色后置于显微镜下观察，参照《真菌鉴定手册》对其进行形态分析与鉴定。采用CTAB 法提取菌株C01的总DNA[7]，设计ITSf（5′-CACGGCTCTACCTGATCGAGGTCAC-3′）和ITSr（5′-CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′）引物，利用PCR技术扩增其ITS片段，产物经TA克隆后测序。将获得的片段进行Blast分析，确定与其亲缘关系最近的种属，并从数据库获得相关种属的ITS序列，利用CLUSTAL X和MEGA4.1软件，采用临近法构建系统发育树，并进行1000 bootstrap检测。
1.2.4 产酶条件优化。在250 ml锥形瓶中进行液体发酵，依次改变种龄（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、培养基初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接种量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%）及发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）中的某一因素，并保持其他发酵条件不变，通过测定CMCase活性，研究各因素对产酶的影响。
1.2.5 不同秸秆发酵试验。保持氮源和发酵条件不变，分别用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆作为碳源发酵7 d，研究菌株C01对其降解效果。
2 结果与分析
2.1菌株筛选通过刚果红透明圈法初筛出 6株形态不同的纤维素降解真菌（图1），分别命名为C01～C06，其中C01、C03水解圈生成速度较快，说明分解纤维素类物质的能力较强（表1）。在相同培养条件下，对所有初筛菌株进行纤维素酶活测定，其中菌株C01的CMC酶活为1.52 IU/ml，高于其他菌株，因此选定C01作为进一步研究对象（表1）。 2.2菌株鉴定菌株C01在CMC-Na培养基上的菌落形态呈圆形，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，初期为白色，后期因分生孢子的产生而呈深绿色，布满一层分生孢子粉（图2）。在油镜下可以看到，菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，不对称分支2～5个，排列紧密，呈两轮生的扫帚状，分生孢子呈圆形或椭圆形（图3）。根据菌落形态观察和镜检结果，参照《真菌鉴定手册》，初步判断菌株C01为青霉属。
培养液初始pH也是影响羧甲基纤维素酶活的一个主要因素。当培养液初始pH为5～6时，菌株C01的酶活较大（表2），而后随着pH的升高，酶活不断下降，表明C01纤维素酶系偏酸性。
接种量对酶活性的影响比较小，由表2可知，随着接种量的增加，酶活力增大，即菌株产酶能力增强，当接种量为12%时，酶活力最高，接种量超过12%后，酶活力变化不大，略有下降。
菌株C01的羧甲基纤维素酶活随着发酵时间的延长，呈现先增后降的趋势，在第5天时达到最大值（表2），随后降低，可能菌体出现老化，产生的蛋白酶影响了羧甲基纤维素酶活，此外，反应过程中产生的纤维素二糖、葡萄糖也能对酶解反应形成反馈抑制。
2.4菌株C01对各种秸秆的降解率 对各种秸秆的降解效果研究表明，菌株C01对秸秆纤维素具有高效降解作用（表3）。其中对玉米秸秆的降解转化率最高，降解率达到66.8%，分别为水稻秸秆和小麦秸秆降解率的1.21和1.25倍，这可能是由于筛选环境为玉米秸秆堆积土壤的原因。
3结论
从常年堆积玉米秸秆的土壤中筛选到6株产纤维素酶的真菌，通过测定羧甲基纤维素酶活得到纤维素酶活最高的菌株C01。对该菌株进行形态学和ITS分子生物学鉴定，确定其为青霉属。对C01产酶条件进行了初步研究，确定该菌株最佳产酶条件为：接种种龄5 d，培养液初始pH 5，接种量12%，培养时间5 d，在此条件下，其酶活力达1.76 IU/ml。该研究筛选到的C01菌株酶活较高，有一定的应用价值，可为下一步玉米秸秆降解的实际应用奠定基础。
参考文献
[1] 孙海彦， 赵平娟， 黎绢华，等. 纤维素酶高产菌株的筛选及鉴定[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（36）： 22206-22208.
[2] 宋颖琦， 杨谦.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2002， 34（2）：197-199.
[3] 韩佳慧， 杨扬， 张景来. 利用回归模型比较秸秆利用方式[J]. 安徽科技学院学报， 2009， 23（6）： 87-91.
[4] 刘尧， 李力， 李俊，等. 玉米秸秆高效腐解复合菌系 CSS-1 的选育及其组成分析[J]. 中国农业科学， 2010， 43（21）： 4437-4446.
[5] 郭夏丽， 程小平， 杨小丽，等. 高效玉米秸秆降解菌复合系的构建[J]. 中国农学通报， 2010， 26（7）： 261-266.
[6] 宋穎琦， 刘睿倩， 杨谦， 等. 纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2002， 34（2）： 197-200.
关键词玉米秸秆；纤维素降解；分离；产酶条件
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01159-03
基金项目牡丹江市科学技术计划项目（玉米秸秆纤维素降解菌的选育及应用研究，G2013n0012）的阶段性研究成果。
作者简介向殿军（1978-），男，黑龙江望奎人，讲师，博士，从事农业基础研究。*通讯作者，讲师，博士，从事食品基础研究。
纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，占植物干重的1/3～1/2，全球一年间由光合作用生产的纤维素约1.5×109 t[1-2]。我国是一个农业大国，每年的秸秆产量约7.0亿t，其中玉米秸秆占2.2亿t[3]。纤维素中由于存在许多高能的氢键，因此其水解、利用均很困难，89%的秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。秸秆还田可补充土壤有机质，维持土地利用的物质平衡，利于农业可持续发展，是降解秸秆的一种良好途径。相对于间接还田方式，玉米秸秆原位还田可减轻劳动强度，节省成本，已经在农区广为推广应用。然而，我国北方地区玉米收获、秸秆还田是在深秋时节，由于气候干燥、温度偏低，原位还田的玉米秸秆自然腐解速度缓慢，给农业生产带来许多不利影响，导致秸秆还田应用阻力较大，应用面积小，配施适当的秸秆降解菌剂是解决该问题的有效方法[4-5]。但目前纤维素酶生产菌株的酶活力不高，因此筛选高活力的纤维素酶生产菌株是开展秸秆原位还田和堆沤还田的一个关键前提。该研究从常年堆积玉米秸秆的土壤中筛选到1株高纤维素酶活的纤维素降解真菌，通过分子生物学手段对其进行了鉴定，并对其产酶条件进行了初步研究， 以期为提高玉米秸秆的利用率提供优质的菌种资源和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品。土壤样品采集自牡丹江市郊区玉米秸秆堆积处。玉米秸秆为成熟玉米秸秆地上部分，晒干、粉碎过80目筛备用。
1.1.2培养基。玉米秸秆筛选培养基：2%玉米秸秆粉，0.3% NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%琼脂，自然pH。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：1%CMC-Na，0.3%NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%琼脂，自然pH。种子培养基：20%马铃薯，2%蔗糖，自然 pH，固体培养基加入2%琼脂。液体发酵产酶培养基：0.75%玉米秸秆粉，0.75%麸皮，0.5%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨。
1.2试验方法
1.2.1 纤维素分解单菌株的筛选。将玉米秸秆堆腐样品按适当梯度稀释后接种至玉米秸秆筛选培养基上，30 ℃培养3 d进行增殖，挑取单菌落经3次平板划线分离培养获得纯菌落，点接种于CMC-Na平板上，用1 mg/L刚果红溶液染色1 h，再用1 mol/L 的NaCl溶液洗脱1 h后，测水解圈直径。根据D值（D=水解圈直径/天数）的大小进行初筛。将初筛的菌株接种于种子培养基中，30 ℃，180 r/min震荡培养5 d，然后接种到液体发酵产酶培养基中，30 ℃，180 r/min震荡培养5 d，测定羧甲基纤维素酶（CMCase）活力，选取酶活最高的菌株试管斜面保存备用，作为进一步研究的对象。
1.2.2 酶活测定。取发酵液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集上清液即得粗酶液。按宋颖琦等[6]试验方法进行CMC酶活力测定。
1.2.3菌株形态和ITS序列鉴定。将菌株接种到平板上，培养3 d，观察菌落的特征。在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上，染色后置于显微镜下观察，参照《真菌鉴定手册》对其进行形态分析与鉴定。采用CTAB 法提取菌株C01的总DNA[7]，设计ITSf（5′-CACGGCTCTACCTGATCGAGGTCAC-3′）和ITSr（5′-CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′）引物，利用PCR技术扩增其ITS片段，产物经TA克隆后测序。将获得的片段进行Blast分析，确定与其亲缘关系最近的种属，并从数据库获得相关种属的ITS序列，利用CLUSTAL X和MEGA4.1软件，采用临近法构建系统发育树，并进行1000 bootstrap检测。
1.2.4 产酶条件优化。在250 ml锥形瓶中进行液体发酵，依次改变种龄（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、培养基初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接种量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%）及发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）中的某一因素，并保持其他发酵条件不变，通过测定CMCase活性，研究各因素对产酶的影响。
1.2.5 不同秸秆发酵试验。保持氮源和发酵条件不变，分别用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆作为碳源发酵7 d，研究菌株C01对其降解效果。
2 结果与分析
2.1菌株筛选通过刚果红透明圈法初筛出 6株形态不同的纤维素降解真菌（图1），分别命名为C01～C06，其中C01、C03水解圈生成速度较快，说明分解纤维素类物质的能力较强（表1）。在相同培养条件下，对所有初筛菌株进行纤维素酶活测定，其中菌株C01的CMC酶活为1.52 IU/ml，高于其他菌株，因此选定C01作为进一步研究对象（表1）。 2.2菌株鉴定菌株C01在CMC-Na培养基上的菌落形态呈圆形，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，初期为白色，后期因分生孢子的产生而呈深绿色，布满一层分生孢子粉（图2）。在油镜下可以看到，菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，不对称分支2～5个，排列紧密，呈两轮生的扫帚状，分生孢子呈圆形或椭圆形（图3）。根据菌落形态观察和镜检结果，参照《真菌鉴定手册》，初步判断菌株C01为青霉属。
培养液初始pH也是影响羧甲基纤维素酶活的一个主要因素。当培养液初始pH为5～6时，菌株C01的酶活较大（表2），而后随着pH的升高，酶活不断下降，表明C01纤维素酶系偏酸性。
接种量对酶活性的影响比较小，由表2可知，随着接种量的增加，酶活力增大，即菌株产酶能力增强，当接种量为12%时，酶活力最高，接种量超过12%后，酶活力变化不大，略有下降。
菌株C01的羧甲基纤维素酶活随着发酵时间的延长，呈现先增后降的趋势，在第5天时达到最大值（表2），随后降低，可能菌体出现老化，产生的蛋白酶影响了羧甲基纤维素酶活，此外，反应过程中产生的纤维素二糖、葡萄糖也能对酶解反应形成反馈抑制。
2.4菌株C01对各种秸秆的降解率 对各种秸秆的降解效果研究表明，菌株C01对秸秆纤维素具有高效降解作用（表3）。其中对玉米秸秆的降解转化率最高，降解率达到66.8%，分别为水稻秸秆和小麦秸秆降解率的1.21和1.25倍，这可能是由于筛选环境为玉米秸秆堆积土壤的原因。
3结论
从常年堆积玉米秸秆的土壤中筛选到6株产纤维素酶的真菌，通过测定羧甲基纤维素酶活得到纤维素酶活最高的菌株C01。对该菌株进行形态学和ITS分子生物学鉴定，确定其为青霉属。对C01产酶条件进行了初步研究，确定该菌株最佳产酶条件为：接种种龄5 d，培养液初始pH 5，接种量12%，培养时间5 d，在此条件下，其酶活力达1.76 IU/ml。该研究筛选到的C01菌株酶活较高，有一定的应用价值，可为下一步玉米秸秆降解的实际应用奠定基础。
参考文献
[1] 孙海彦， 赵平娟， 黎绢华，等. 纤维素酶高产菌株的筛选及鉴定[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（36）： 22206-22208.
[2] 宋颖琦， 杨谦.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2002， 34（2）：197-199.
[3] 韩佳慧， 杨扬， 张景来. 利用回归模型比较秸秆利用方式[J]. 安徽科技学院学报， 2009， 23（6）： 87-91.
[4] 刘尧， 李力， 李俊，等. 玉米秸秆高效腐解复合菌系 CSS-1 的选育及其组成分析[J]. 中国农业科学， 2010， 43（21）： 4437-4446.
[5] 郭夏丽， 程小平， 杨小丽，等. 高效玉米秸秆降解菌复合系的构建[J]. 中国农学通报， 2010， 26（7）： 261-266.
[6] 宋穎琦， 刘睿倩， 杨谦， 等. 纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2002， 34（2）： 197-200.