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摘要[目的] 为肝素钠的大规模生产提供依据。[方法] 利用3种复合酶从肠渣中提取肝素钠，通过测定提取肝素钠的质量、蛋白含量以及效价对3种复合酶法进行评价。[结果]由木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最高（47%），效价为15 USPU/mg；由胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量为29%， 而其效价为34 USPU/mg。由2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最少（24%），效价最高（39 USPU/mg）。[结论] 2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶能有效提取肠渣中残留的肝素钠。
关键词肝素钠；肠渣；酶解；复合酶
中图分类号S852文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01074-01
基金项目江苏省农业科技支撑项目（BE2012400）。
作者简介孙学超（1987- ），男，山东惠民人，硕士，从事多糖类药物研究。*通讯作者，高级经济师，从事肠衣及肝素钠的经营及相关技术、工艺研究。
肝素主要来源于动物富含肥大细胞的组织（如肝、肺、内肠等），以O-连接形式与核心蛋白（Core protein，CP）形成肝素蛋白聚糖（Heparin proteoglycan，HepPG）形态存在[1]。肝素可以与百余种蛋白（如LDL、VLDL、LPL、SOD、AT Ш、IgG等）相互作用，呈现出降血脂[2]、抗动脉粥样硬化[3]、免疫调节[4]、抗炎、抗肿瘤[5]、抗单纯孢疹病毒[6]、抗凝血[7]等生物活性。肝素于1920年就开始其大规模制备研究，并于1935年应用于临床，是目前世界上产量和销售量最大的来自天然的糖类药物，10 mg肝素钠能在4 h内抑制500 ml血液凝固[8]，目前还没有任何一种药物可以代替它。在肝素生产中，盐解法具有操作简单且提取的肝素中杂质少等优点从而被国内有很多的厂家采用，但是盐解法在高温使蛋白变性时会包裹肝素钠形成肠渣，造成了肝素钠提取率降低的现象，从而带来损失。肠渣蛋白中既有球状蛋白亦有链状蛋白，使用单一的酶很难对其酶解彻底。笔者利用3种复合酶对肠渣进行酶解，提取夹杂在肠渣中的肝素钠，从而为企业大规模生产提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料供试肠渣取自南通天龙畜产品有限公司；绵羊血浆购自苍山向明生化助剂厂；肝素钠标准品和标准牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司），2709碱性蛋白酶（≥100 000 U/g），购自北京博士奥生物科技有限公司）；胰蛋白酶（≥250 000 U/g），購自美国Sigma公司；链蛋白酶（≥7 000 U/g ），购自美国Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥3 000 U/g），购自美国Sigma公司；乙醇、丙酮和氢氧化钠等常规试剂均为国产分析纯。
1.2主要仪器R200型旋转蒸发仪（瑞士BCHI公司）；数显恒温水浴锅（上海华康实验仪器有限公司）；BT25s分析天平（德国Sartorius公司）；UNIQUER20纯水仪（锐思捷科学仪器有限公司）；UV2102 PCS 紫外可见分光光度计（日本尤尼柯公司）；真空干燥箱（化康实验仪器厂）；082恒温磁力搅拌器（上海梅颍浦公司）；TDL40B型离心机（安亭科学仪器厂）。
1.3试验方法
1.3.1木瓜蛋白酶和链酶复合酶酶解肠渣。将脱水脱盐后烘干的肠渣粉碎，过40目筛，取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCL（pH 6.5）中，加入木瓜蛋白酶0.5 g，60 ℃保温搅拌2 h，调节pH至7.5，补加链蛋白酶0.1 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到MT。
1.3.2胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶酶解肠渣。取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.5 g，40 ℃保温搅拌2 h，调节pH至7.5，补加链蛋白酶0.1 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温灭活10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到YT。
1.3.32709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶酶解肠渣。取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.1 g，40 ℃保温搅拌2 h，调节pH至9.0，补加2709碱性蛋白酶0.5 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温灭活10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到JT。
1.3.4蛋白含量及效价的测定。采用Folin-酚法测定粗蛋白含量[9]。采用美标法测定样品效价。估测样品效价，并将其配成8 USPU/mg的供试溶液，然后取管径均匀、干净的具塞试管，加入梯度浓度的效价为8 USPU/ml的肝素钠标准品溶液和供试品溶液，并加入羊血浆1.00 ml和0.25 %氯化钙试液0.80 ml，塞盖，摇匀使试管内壁完全润湿后立即计时，37 ℃条件下放置1 h后，观察并记录各管凝血状况，并按照以下公式计算供试液的效价：
效价=肝素钠标准品V1/2供试液V1/2×估计效价
2结果与分析
MT、YT和JT均是通过酶解后通过截留分子量为3 500 Da透析袋透析完全。由表1可知，MT、YT和JT的蛋白含量分别为47 %、29%和24%（蛋白含量标准曲线见图1），说明2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶较前2种复合酶更能解断肠渣中蛋白，但其蛋白含量还有24 %需要运用其他方法进一步纯化；MT、YT和JT的效价分别为15、34和39 USPU/mg，说明蛋白会影响肝素的效价。如果MT、YT和JT中只含蛋白和肝素，效价会远远高于39 USPU/mg，据此推测MT、YT和JT中不仅含有肝素及蛋白或许有软骨素类透明质酸等抗凝活性较弱的糖类，有待进一步研究。肠渣酶解后的酶解液提取完肝素后直接喷雾干燥获得低分子量的肠膜蛋白。 3小结
笔者探讨了以木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶、胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶以及2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶3种复合酶对肠渣进行分解提取肝素钠，并对MT、YT和JT的质量、蛋白含量以及效价进行测定，其中由2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶提取的肝素（JT）中蛋白含量最低（24%），效价最高为39 USPU/mg，为以肠渣为原料提取肝素以及生产肠膜蛋白的大规模生产提供依据。
参考文献
[1] LOGANATHAN D，WANG H M，MALLIS L M，et al.Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources[J].Biochemistry，1990，29（18）：4362-4368.
[2] KUMEROVA A O，SILOVA A A，LIA U.Effect of pantethine on post-heparin lipolytic activity and lipid peroxidation in the myocardium[J].Biulleten' Eksperimental'noi Biologiii Meditsiny，1991，111（1）：33-35.
[3] RAGAZZI E，CHINELLATO A.Heparin：pharmacological potentials from atherosclerosis to asthma[J].General Pharmacology：The Vascular System，1995，26（4）：697-701.
[4] GRACHER A H P，CIPRIANI T R，CARBONERO E R，et al.Antithrombin and heparin cofactor II-mediated inactivation of α-thrombin by a synthetic，sulfated mannogalactan[J].Thrombosis Research，2010，126（3）：180-187.
[5] SALAS A，SANS M，SORIANO A，et al.Heparin attenuates TNF-α induced inflammatory response through a CD11b dependent mechanism[J].Gut，2000，47（1）：88-96.
[6] GHOSH T，CHATTOPADHYAY K，MARSCHALL M，et al.Focus on antivirally active sulfated polysaccharides：from structure-activity analysis to clinical evaluation[J].Glycobiology，2009，19（1）：2-15.
[7] ANDERSSON L，BARROWCLIFFE T W，HOLMER E，et al.Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity chromatography on matrix-bound antithrombin III and by gel filtration[J].Thrombosis Research，1976，9（6）：575-583.
[8] GRIFFITH G C，SILVERGLADE A.SYMPOSIUM ON HEPARIN.INTRODUCTION.[J].The American Journal of Cardiology，1964，14：1.
[9] 王培培，于廣利，杨波，等.选育羊栖菜与野生羊栖菜中褐藻胶与褐藻糖胶组成分析[J].中国海洋药物，2009（3）：39-43.
关键词肝素钠；肠渣；酶解；复合酶
中图分类号S852文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01074-01
基金项目江苏省农业科技支撑项目（BE2012400）。
作者简介孙学超（1987- ），男，山东惠民人，硕士，从事多糖类药物研究。*通讯作者，高级经济师，从事肠衣及肝素钠的经营及相关技术、工艺研究。
肝素主要来源于动物富含肥大细胞的组织（如肝、肺、内肠等），以O-连接形式与核心蛋白（Core protein，CP）形成肝素蛋白聚糖（Heparin proteoglycan，HepPG）形态存在[1]。肝素可以与百余种蛋白（如LDL、VLDL、LPL、SOD、AT Ш、IgG等）相互作用，呈现出降血脂[2]、抗动脉粥样硬化[3]、免疫调节[4]、抗炎、抗肿瘤[5]、抗单纯孢疹病毒[6]、抗凝血[7]等生物活性。肝素于1920年就开始其大规模制备研究，并于1935年应用于临床，是目前世界上产量和销售量最大的来自天然的糖类药物，10 mg肝素钠能在4 h内抑制500 ml血液凝固[8]，目前还没有任何一种药物可以代替它。在肝素生产中，盐解法具有操作简单且提取的肝素中杂质少等优点从而被国内有很多的厂家采用，但是盐解法在高温使蛋白变性时会包裹肝素钠形成肠渣，造成了肝素钠提取率降低的现象，从而带来损失。肠渣蛋白中既有球状蛋白亦有链状蛋白，使用单一的酶很难对其酶解彻底。笔者利用3种复合酶对肠渣进行酶解，提取夹杂在肠渣中的肝素钠，从而为企业大规模生产提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料供试肠渣取自南通天龙畜产品有限公司；绵羊血浆购自苍山向明生化助剂厂；肝素钠标准品和标准牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司），2709碱性蛋白酶（≥100 000 U/g），购自北京博士奥生物科技有限公司）；胰蛋白酶（≥250 000 U/g），購自美国Sigma公司；链蛋白酶（≥7 000 U/g ），购自美国Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥3 000 U/g），购自美国Sigma公司；乙醇、丙酮和氢氧化钠等常规试剂均为国产分析纯。
1.2主要仪器R200型旋转蒸发仪（瑞士BCHI公司）；数显恒温水浴锅（上海华康实验仪器有限公司）；BT25s分析天平（德国Sartorius公司）；UNIQUER20纯水仪（锐思捷科学仪器有限公司）；UV2102 PCS 紫外可见分光光度计（日本尤尼柯公司）；真空干燥箱（化康实验仪器厂）；082恒温磁力搅拌器（上海梅颍浦公司）；TDL40B型离心机（安亭科学仪器厂）。
1.3试验方法
1.3.1木瓜蛋白酶和链酶复合酶酶解肠渣。将脱水脱盐后烘干的肠渣粉碎，过40目筛，取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCL（pH 6.5）中，加入木瓜蛋白酶0.5 g，60 ℃保温搅拌2 h，调节pH至7.5，补加链蛋白酶0.1 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到MT。
1.3.2胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶酶解肠渣。取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.5 g，40 ℃保温搅拌2 h，调节pH至7.5，补加链蛋白酶0.1 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温灭活10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到YT。
1.3.32709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶酶解肠渣。取5 g肠渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.1 g，40 ℃保温搅拌2 h，调节pH至9.0，补加2709碱性蛋白酶0.5 g，55 ℃保温2 h，将温度升至100 ℃并保温灭活10 min，离心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，浓缩后醇沉，乙醇脱水后真空干燥得到JT。
1.3.4蛋白含量及效价的测定。采用Folin-酚法测定粗蛋白含量[9]。采用美标法测定样品效价。估测样品效价，并将其配成8 USPU/mg的供试溶液，然后取管径均匀、干净的具塞试管，加入梯度浓度的效价为8 USPU/ml的肝素钠标准品溶液和供试品溶液，并加入羊血浆1.00 ml和0.25 %氯化钙试液0.80 ml，塞盖，摇匀使试管内壁完全润湿后立即计时，37 ℃条件下放置1 h后，观察并记录各管凝血状况，并按照以下公式计算供试液的效价：
效价=肝素钠标准品V1/2供试液V1/2×估计效价
2结果与分析
MT、YT和JT均是通过酶解后通过截留分子量为3 500 Da透析袋透析完全。由表1可知，MT、YT和JT的蛋白含量分别为47 %、29%和24%（蛋白含量标准曲线见图1），说明2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶较前2种复合酶更能解断肠渣中蛋白，但其蛋白含量还有24 %需要运用其他方法进一步纯化；MT、YT和JT的效价分别为15、34和39 USPU/mg，说明蛋白会影响肝素的效价。如果MT、YT和JT中只含蛋白和肝素，效价会远远高于39 USPU/mg，据此推测MT、YT和JT中不仅含有肝素及蛋白或许有软骨素类透明质酸等抗凝活性较弱的糖类，有待进一步研究。肠渣酶解后的酶解液提取完肝素后直接喷雾干燥获得低分子量的肠膜蛋白。 3小结
笔者探讨了以木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶、胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶以及2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶3种复合酶对肠渣进行分解提取肝素钠，并对MT、YT和JT的质量、蛋白含量以及效价进行测定，其中由2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶提取的肝素（JT）中蛋白含量最低（24%），效价最高为39 USPU/mg，为以肠渣为原料提取肝素以及生产肠膜蛋白的大规模生产提供依据。
参考文献
[1] LOGANATHAN D，WANG H M，MALLIS L M，et al.Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources[J].Biochemistry，1990，29（18）：4362-4368.
[2] KUMEROVA A O，SILOVA A A，LIA U.Effect of pantethine on post-heparin lipolytic activity and lipid peroxidation in the myocardium[J].Biulleten' Eksperimental'noi Biologiii Meditsiny，1991，111（1）：33-35.
[3] RAGAZZI E，CHINELLATO A.Heparin：pharmacological potentials from atherosclerosis to asthma[J].General Pharmacology：The Vascular System，1995，26（4）：697-701.
[4] GRACHER A H P，CIPRIANI T R，CARBONERO E R，et al.Antithrombin and heparin cofactor II-mediated inactivation of α-thrombin by a synthetic，sulfated mannogalactan[J].Thrombosis Research，2010，126（3）：180-187.
[5] SALAS A，SANS M，SORIANO A，et al.Heparin attenuates TNF-α induced inflammatory response through a CD11b dependent mechanism[J].Gut，2000，47（1）：88-96.
[6] GHOSH T，CHATTOPADHYAY K，MARSCHALL M，et al.Focus on antivirally active sulfated polysaccharides：from structure-activity analysis to clinical evaluation[J].Glycobiology，2009，19（1）：2-15.
[7] ANDERSSON L，BARROWCLIFFE T W，HOLMER E，et al.Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity chromatography on matrix-bound antithrombin III and by gel filtration[J].Thrombosis Research，1976，9（6）：575-583.
[8] GRIFFITH G C，SILVERGLADE A.SYMPOSIUM ON HEPARIN.INTRODUCTION.[J].The American Journal of Cardiology，1964，14：1.
[9] 王培培，于廣利，杨波，等.选育羊栖菜与野生羊栖菜中褐藻胶与褐藻糖胶组成分析[J].中国海洋药物，2009（3）：39-43.